Спосіб підвищення кількості неушкоджених ядровмісних клітин кордової крові людини після кріоконсервування

Abstract

Застосування гемопоетичних прогеніторних клітин (ГПК) міцно увійшло в практичну медицину розвинутих країн світу, як ефективний метод лікування патологій крові, імунної системи, порушень обміну речовин, онкологічних та інших захворювань. На сьогоднішній день одним із джерел для отримання ГПК є кордова кров (КК) людини. Завдяки її унікальним властивостям, відносній простоті та безпеці заготівлі, КК стала одним із найбільш затребуваних джерел ГПК. Щорічно кількість проведених трансплантацій збільшується, а пока- зання до даного виду терапії розширюються. Підвищення частоти застосування КК в клінічній практиці зумовили необхідність створення її запасів. Розрив у часі між моментом заготівлі КК і введенням її в організм реципієнта визначає необхідність застосування технологій, які дозволяють зберігати матеріал тривалий час в біологічно повноцінному стані. Вирішення цього завдання можливе лише при довгостроковому зберіганні КК в замороженому стані. Все це потребує створення мережі кріобанків та розробку спеціальних для даних клітин ефективних протоколів низькотемпературного консервування. Найбільш широко для кріоконсервування ЯВК КК використовується проникаючий в клі- тини кріопротектор диметилсульфоксид (ДМСО) у концентраціях 7,5÷10%. Проте окрім цитопротекторного впливу, ДМСО має й токсичну дію, яка може проявлятися збільшенням кількості актив- них форм кисню в клітинах, викликаючи порушення енергетичного стану, пошкодження структурних елементів через перекисне окислення ліпідів, а також пошкодження ДНК, призводячи до апоптозу або некрозу клітин. Виходячи з цього, перспективним напрямком може бути додавання до середовища кріоконсервування антиоксидантів, які були б здатні «перехоплювати» вільні радикали та гальмувати чи знижувати інтенсивність вільнорадикального окислення на всіх ста- діях заморожування-відігрівання. Одними з таких антиоксидантів є глутатіон – головний антиоксидант у клітинах, та N-ацетил-L-цистеїн (АЦ), який характеризується не тільки безпосередньою антиокси- дантною активністю, але й бере участь у синтезі глутатіону та забезпеченні тіоловими групами цитоскелетні структури, тим самим зберігаючи клітини від руйнування. У роботі використовували КК людини. Виділення фракції ЯВК із цільної КК проводили методом седиментації в поліглюкіні (6%-й розчин декстрану (ОАО «Біофарма», Україна) з молекулярною масою 60000). У клітинну суспензію вносили 25%-й розчин ДМСО до кінцевих концентрацій у зразку 7,5 та 10%. У роботі використовували глутатіон («Sigma-Aldrich», США) у кінцевій концентрації 1 та 3 мМ та N-ацетил-L-цистеїн у концентраціях 10 та 15 мМ, які перед кріокон- сервуванням вносили в зразки з ДМСО. Зразки кріоконсервували в програмному заморожувачі («Cryoson», Німеччина) зі швидкістю 1–3 град/хв до –80°С із наступним зануренням у рідкий азот (–196°С). Відігрівання здійснювали при 37°С на водяній бані при постій- ному погойдуванні до зникнення твердої фази. Для оцінки кількості та життєздатності ЯВК КК (CD45+-клітини) використовували стандарт- ний ISHAGE протокол. Оцінку стадій апоптозу ядровмісних клітин проводили з одночасним внесенням до зразків маркерів AnnexinV FITC, CD45 PE і 7-AAD. Вимірювання проводили методом проточної цитофлуориметрії на проточному цитофлуориметрі «FACS Calіbur» («BD») при довжині хвилі збудження 488 нм. Аналіз стану ЯВК КК показав, що після кріоконсервування до 30% ЯВК знаходилося на різних стадіях апоптозу/некрозу. Виходячи з цього стає зрозуміло, що кількість функціонально активних клітин в пробах не перевищує 70%. Аналіз клітин, які мали ті чи інші порушення, показав, що незалежно від концентрації кріопротектора, велика їх частина характеризувалася пошкодженням цілісності мембрани (при збереженні впорядкованості ліпідів) та фрагментацією ДНК в ядрі, що характерно для клітин, які перебувають на стадії некрозу (AnnexinV-7AAD+). Тобто в процесі кріоконсервування основні втрати клітин відбуваються в результаті прямого впливу пошкоджуючих фізичних та/або хімічних факторів, на які клітини не можуть або ж не встигають відреагувати за допомогою своїх захисних систем. Отримані дані з визначення кількості клітин, які не зв’язались ні з AnnexinV, ні з 7AAD (AnnexinV-7AAD--клітини) показали, що при використанні ДМСО в концентраціях 7,5 та 10% сумісно з АЦ в концентраціях 10 та 15 мМ можливе зберігання до 82,2% клітин, в яких не спостерігалося будь яких структурних змін (ці клітини під час попадання до організму реципієнта зможуть повною мірою реалізувати свої терапевтичні властивості). Це пов’язано з вираженими антиокси- дантними властивостями АЦ за даних концентрацій, що, як було показано нами в попередніх роботах, підтверджується наявністю най- меншої кількості клітин із надлишковим вмістом АФК у цих зразках після кріоконсервування. Результати, отримані під час оцінки кількості неушкоджених клітин (AnnexinV-/7AAD-) з глутатіоном показали, що додавання даного антиоксиданту у концентрації 1 та 3 мМ до кріозахисного середовища з 7,5% ДМСО дозволило зберігати до 84,7% життєздатних ЯВК після кріоконсервування, а при додаванні до кріозахисного середовища з 10% ДМСО – до 80,1%, що на 10-15% більше порівняно зі зразками, до яких не вносили антиоксидант. Аналізуючи отримані результати з дослідження кількості клітин, які перебували на різних стадіях апоптозу/некрозу після кріоконсерву- вання в розчинах із різною концентрацією ДМСО та глутатіону можна відзначити зниження кількості клітин із дезорганізованою мембраною (AnnexinV-/7AAD+) в усіх групах. У зразках, кріоконсервованих із ДМСО у концентрації 7,5% та глутатіоном у концентраціях 1 та 3 мМ, кількість даних клітин була значуще нижчою у 2 та 2,5 рази, від- повідно, порівняно з контрольними значеннями без додавання анти- оксиданту та склала 8,2±1,3 та 6,7±1,1%, відповідно. Підсумовуючи усе вищезазначене, можна зробити висновок, що процес кріоконсервування клітин супроводжується зміною їх фізико-хімічних властивостей для адаптації до факторів заморожування з метою максимального збереження функціональної повноцінності клі- тин після відігрівання, а також різними пошкодженнями, які можуть бути незначними і мати зворотній характер або серйозними і призво- дити до загибелі клітин. Додавання до кріозахисного середо- вища глутатіону та N-ацетил-L-цистеїну може розглядатися як перспективний метод підвищення кількості неушкоджених ЯВК КК після кріоконсервування.