УКРАЇНА (19) UA (11) 116919 (13) C2 (51) МПК (2018.01) A61B 10/00 G01N 33/483 (2006.01) МІНІСТЕРСТВО ЕКОНОМІЧНОГО РОЗВИТКУ І ТОРГІВЛІ УКРАЇНИ U A 1 1 6 9 1 9 C 2 (12) ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ЦИТОПЛАЗМАТИЧНИХ МЕМБРАН (57) Реферат: Винахід належить до медицини і може бути використаний в клінічній біохімії й фізіології, терапії й профілактичній медицині, токсикології, судовій медицині й лабораторних дослідженнях. Спосіб діагностики структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран включає визначення інтенсивності спонтанної хемілюмінесценції, індукованої FeCl3 хемілюмінесценції, люмінол-залежної й індукованої FeCl3 хемілюмінесценції сироватки крові щурів на 30 й 60 добу (21) Номер заявки: a 2016 05284 (22) Дата подання заявки: 16.05.2016 (24) Дата, з якої є чинними права на винахід: 25.05.2018 (41) Публікація відомостей про заявку: 25.11.2016, Бюл.№ 22 (46) Публікація відомостей про видачу патенту: 25.05.2018, Бюл.№ 10 (72) Винахідник(и): Жерновая Марина Євгеніївна (UA), Вишницька Ірина Анатоліївна (UA), Жуков Віктор Іванович (UA), Комаревцева Ірина Олександрівна (UA), Наконечна Оксана Анатоліївна (UA), Андросов Євген Дмитрович (UA) (73) Власник(и): ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, пр. Науки, 4, м. Харків, 61022 (UA) (74) Представник: Голданська Анна Вадимівна (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: UA 28193 U, 26.11.2007 Сіренко О.В. Визначення стану цитоплазматичних клітинних мембран за допомогою методів біохемілюмінісценції та фосфоресценції // Вісник харківського національного університету. – 2007. - № 774. С. 46-49 Єфіменко Н.В. та ін.Структурно- функціональний стан еритроцитарних мембран периферичної крові щурів за алкогольної інтоксикації на фоні введення L-аргініну та L-NAME // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин і Державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок. – 2014. - Вип. 15. - № 4. – С. 21-27 Лучинскьий М.А., Лучинський В.М. Структурно-функціональний стан кісткової тканини у дітей, які проживають на екологічно несприятливих територіях // Буковинський медичний вісник. – 2013. – Том 17. - № 1 (65). – С. 55- 59 UA 116919 C2 дії на них 1/10, 1/100 й 1/1000 DL50 поліоксипропіленгліколю з молекулярною масою 2100 й товарною назвою "Лапрол" (Л-2102), інтенсивності фосфоресценції сироватки, текучість цитоплазматичних мембран еритроцитів і лімфоцитів, окислювальну модифікацію білків мембран даних клітин на 60 добу впливу 1/10 й 1/100 DL50 цього ксенобіотика й додатково - відсотковий вміст фосфатидилетаноламіну, сфінгомієліну, фосфатидилінозитолу, фосфатидилсерину, фосфатидилхоліну, лізофосфатидилетаноламіну, лізофосфатидилхоліну й кардіоліпину в мембранах еритроцитів, лімфоцитів і гепатоцитів на 60 добу токсифікації тварин 1/100 DL50 Л-2102, а також іонну проникність мембран еритроцитів (швидкість самовільного й індукованого валіноміцином виходу іонів K + з даних клітин, сумарну кількість цих іонів на 1 млн останніх) на 60 добу дії на щурів 1/10 й 1/100 DL50 ксенобіотика. UA 116919 C2 1 Винахід належить до медицини, а саме до експериментальної медицини, і може бути використаний в клінічній біохімії й фізіології, терапії, профілактичній медицині, токсикології, судовій медицині й лабораторних дослідженнях. Актуальність предмету винаходу пов'язана з тим, що сучасні уявлення про патологічні й донозологічні стани все більше спираються на провідну роль структурно-функціональних 5 одиниць організму, як цілісної системи, у підтриманні динамічної гомеостатичної рівноваги й здатності адаптуватися до змін внутрішнього й навколишнього середовища. Такими одиницями є цитоплазматичні мембрани, які відповідають не тільки за регуляцію транспорту речовин, а також і за здійснення міжклітинних контактів шляхом активації рецепторів і специфічних ділянок ідентифікації. У цьому зв'язку, визначення порушень структури й функції клітинних мембран є 10 важливим діагностичним і прогностичним компонентом, що набуває все більшої значимості в умовах постійно зростаючого антропогенного навантаження, особливо при тривалому впливі субтоксичних доз ксенобіотиків. Відомий спосіб оцінки структури цитоплазматичної клітинної мембрани, що здійснюють шляхом електронної мікроскопії, яка дозволяє визначити кількість слоїв мембрани й наявність їх 15 помітних ушкоджень [Казначеев В.П., Михайлов Л.П. Сверхслабые излучения в межклеточных взаимодействиях // Новосибирск: Наука, 1981. - 144 с.]. Однак, недоліком цього способу є порушення структури мембрани в процесі фіксації, фарбування й підготовки зразку до дослідження, а також неможливість оцінки окремо стану ліпідного й білкового компонентів, їх конформаційних змін та окислювальної модифікації білків у 20 динаміці. Не можуть бути досліджені методом електронної мікроскопії й окремі молекули цитоплазматичної мембрани, тому що препарати потребують фарбування важкими металами й використання підкладки. Існує також спосіб оцінки структури біоматеріалу за допомогою електронно-парамагнітного резонансу, який засновано на реєстрації резонансного поглинання електромагнітної енергії в 25 сантиметровому діапазоні довжини хвиль речовинами, що вміщують парамагнітні частинки. І даний біофізичний метод дозволяє досліджувати сироватку й сечу, робити комплексні висновки відносно ушкоджень як ліпідних, так і білкових мембранних структур та оцінювати їх конформаційні зміни, що віддзеркалюють функціональну активність клітини [Дубинина Е.Е., Бурмистрова P.O., Хадиев Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белка. Методы ее 30 определения // Вопросы мед. химии. - 1996. - Т. 41, Вып. 1. - С. 24-26]. Але, цей спосіб не дає змоги визначити ушкодження цитоплазматичної мембрани в разі відсутності в зразку біоматеріалу неспарених електронів. До того ж, він не дозволяє комплексно оцінити функції біомембран організму, що зазнає впливу ксенобіотиків. Нарешті, спосіб електронно-парамагнітного резонансу, як і спосіб електронної мікроскопії, є достатньо складним 35 і передбачає наявність дефіцитної й дорогої апаратури. Відомий також спосіб діагностики структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран, який включає проведення біохемілюмінесцентних і фосфоресцентних досліджень біологічного матеріалу, що дозволяє на основі змін співвідношення інтенсивності спалаху світіння й кінетики реакції оцінити наявність і ступінь пошкодження ліпідно-білкового шару 40 мембран крові й гомогенатів тканин щурів популяції Вістар, які протягом 45 діб отримували внутрішньошлунково 1/100 середньолетальної дози (DL50) ксенобіотика - Лапролу 303 (Л-303) [Патент України № 28193. МПК G01 N33/483. Спосіб діагностики структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран. Опубл. 26.11.2007, Бюл. № 19]. Даний спосіб діагностики структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран є 45 найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю й результатом, який може бути досягнутий, тому його вибрано за прототип. До недоліків прототипу належить те, що за допомогою цього способу є можливість виявлення наявності пошкодження цитоплазматичних мембран під впливом лише 1/100 DL50 ксенобіотика, хоча й найбільш часто застосовуваної. Причому, що стосується можливості 50 визначення ступеню пошкодження, то фактично її в прототипі не існує. Крім того, даний спосіб передбачає констатацію порушення структури й функції тільки на певний час дії Л-303 (на 45 добу), що не дозволяє судити про динаміку патологічних процесів у мембранах. Нарешті, у відомому способі недостатня увага приділяється визначенню особливостей змін ліпідного компоненту мембран, а що стосується властивостей останніх, то вони обмежені тільки 55 порушеннями їх текучості. В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу діагностики структурно- функціонального стану цитоплазматичних мембран за рахунок розширення арсеналу показників, які уточнюють як структуру цитоплазматичних мембран, так і їх функції, а також використання інших субтоксичних доз ксенобіотика й термінів дослідження. 60 UA 116919 C2 2 Задачу, яку поставлено в основу винаходу, вирішують тим, що у відомому способі діагностики структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран під впливом 1/100DL50 Л-303, що включає дослідження інтенсивності біохемілюмінесценції (БХЛ) сироватки крові, гомогенатів печінки й нирок, фосфоресценції (ФР) сироватки крові, текучості плазматичних мембран еритроцитів і лімфоцитів, а також окислювальної модифікації білків 5 мембран цих клітин на 45 добу токсифікації щурів, згідно з заявленим способом, визначають інтенсивність БХЛ (на 30 й 60 добу) і ФР сироватки крові, текучість плазматичних мембран еритроцитів і лімфоцитів, окислювальну модифікацію білків мембран останніх (на 60 добу) і додатково - відсотковий вміст фракцій фосфоліпідів (ФЛ) у мембранах еритроцитів, лімфоцитів і гепатоцитів, а також іонну проникність мембран еритроцитів на 60 добу дії на щурів 10 субтоксичних доз такого ксенобіотика, як поліоксипропіленгліколь з молекулярною масою 2100 й товарною назвою "Лапрол" (Л-2102). Технічний ефект способу діагностики структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран обумовлений високою діагностичною ефективністю комплексу показників, який заявляється. 15 Спосіб виконують наступним чином. Визначають інтенсивність спонтанної хемілюмінесценції (СХЛ), індукованої FeCl3 хемілюмінесценції (FeCl3-ІХЛ), люмінол-залежної й індукованої FeCl3 хемілюмінесценції (ЛЗ FeCl3-ІХЛ) сироватки крові щурів лінії Вістар на 30 й 60 добу їх токсифікації 1/10, 1/100 й 1/1000 DL50 Л-2102 (попередньо проведені дослідження показали, що 1/10000 DL50 даного ксенобіотика практично не змінювала показники БХЛ сироватки), 20 інтенсивність ФР сироватки крові під впливом тих же доз Л-2102, текучість плазматичних мембран еритроцитів і лімфоцитів, окислювальну модифікацію білків мембран цих клітин на 60 добу дії 1/10 й 1/100 DL50 ксенобіотика (1/1000 DL50 Л-2102 не змінювала показники текучості й окислювальної модифікації) і додатково - вміст таких ФЛ, як фосфатидилетаноламіну (ФЕА), фосфатидилхоліну (ФХ), сфінгомієліну (CM), фосфатидилсерину (ФС), 25 лізофосфатидилетаноламіну (ЛФЕА), лізофосфатидилхоліну (ЛФХ), фосфатидилінозитолу (ФІ) і кардіоліпину (КЛ) у мембранах еритроцитів, лімфоцитів і гепатоцитів на 60 добу впливу 1/100 DL50 ксенобіотика, а також самовільний та індукований валіноміцином вихід іонів K + з еритроцитів і сумарну кількість даних іонів на 1 млн останніх на той же термін токсифікації тварин 1/10 й 1/100 DL50 Л-2102 (1/1000 DL50 ксенобіотика не змінювала показники виходу іонів 30 та їх сумарну кількість). Що стосується можливих сумнівів відносно природи взятого в заявленому способі ксенобіотика (Л-2102), то нами в цьому зв'язку проведені відповідні дослідження, які підтвердили в цілому аналогічність ушкоджуючої дії, зокрема його 1/100 DL50, на цитоплазматичні мембрани тих же клітин у порівнянні з тією ж дозою Л-303, вплив якого 35 вивчався в прототипі. Так, у сироватці крові обстежених нами щурів спостерігалося зростання інтенсивності СХЛ, FeCl3-ІХЛ, а також ЛЗ FeCl3-ІХЛ і при дії Л-2102, причому не тільки 1/100, а й 1/10 та 1/1000 його DL50 на 30 добу токсифікації тварин. Найбільш високі рівні досліджуваних показників спостерігались у щурів, на яких впливали 1/10 DL50 (у середньому в 2,6; 2,8 та 1,4 разу), середні 40 - 1/100 DL50 (в 1,9; 2,6 та 1,4 разу) і найменші - 1/1000 DL50 ксенобіотика (в 1,6; 2,1 й 1,02 разу відповідно). Залишилися підвищеними показники в порівнянні з групою контролю й на 60 добу експерименту, знов же, у результаті впливу не тільки 1/100, а й 1/1000 DL50 Л-2102 (в 1,9; 2,7 та 1,3 разу, а також в 1,7; 2,2 та 1,05 разу відповідно). Однак, при токсифікації тварин 1/10 DL50 ксенобіотика було виявлено зниження інтенсивності СХЛ, FeCl3-ІХЛ і ЛЗ FeCl3-ІХЛ - в 1,3; 1,1 й 45 1,9 разу відповідно. Тобто, ці дані свідчать, що 1/10, 1/100 й 1/1000 DL50 Л-2102 теж є активаторами вільнорадикальних процесів і перекисного окислення ліпідів клітинних мембран, які супроводжуються генерацією активних форм кисню, гідроперекисів, перекисів, вільних радикалів. Зменшення інтенсивності БХЛ на 60 добу дії 1/10 DL50 цього ксенобіотика може 50 свідчити про деструктивні процеси в різних органах і тканинах, що супроводжуються надходженням до сироватки крові вільних сульфгідрильних груп і цистеїну, які є пригнічувачами над слабкого світіння. Тому, 1/10 DL50 Л-2102 слід розглядати як таку, що в разі тривалого впливу призводить до зриву захисно-пристосувальних механізмів, які поєднані з розвитком патологічних процесів і пригніченням системи антиоксидантного захисту, тоді як дія 1/100 й 55 1/1000 DL50 ксенобіотика й на даний термін дослідження проявляється значною напругою останніх (табл. 1). UA 116919 C2 3 Таблиця 1 Вплив Л-2102 на динаміку інтенсивності БХЛ сироватки крові в умовах тривалої субтоксичної дії (1°-імп/с) Показники, терміни Група спостереження, M±m (DL50) Контроль (n=10) 1/10 (n=10) 1/100 (n=10) 1/1000 (n=10) 30 доба: СХЛ, FeCl3-ІХЛ, ЛЗ FeCl3-ІХЛ 134,3±9,5 348,4±16,2* 260,3±18,4* 215,4±13,5* 672,4±15,6 1873,5±24,8* 1742,6±22,7* 1427,5±16,3* 1795,6±31,4 2463,7±33,5* 2241,5±28,9* 1832,6±21,4* 60 доба: СХЛ, FeCl3-ІХЛ, ЛЗ FeCl3- ІХЛ 152,7±11,8 114,6±7,9* 295,6±14,8* 257,4±17,5* 683,6±16,7 617,8±11,6* 1863,7±25,8* 1485,6±20,7* 1788,4±40,5 965,3±17,4* 2362,8±37,9* 1882,6±18,5* Примітка: у таблицях 1-6 * - різниця вірогідна (р < 0,05). Підвищувалася під впливом досліджуваного ксенобіотика й інтенсивність ФР сироватки крові щурів на 60 добу їх токсифікації, причому не тільки 1/100 його DL50, а й 1/10 та 1/1000 DL50 (табл. 2), що може свідчити про наявність високих рівнів триплетних збуджених станів, обумовлених 5 непоєднаними електронами, які супроводжуються зміною конформаційної структури білкових молекул і можуть бути поєднані з їх окислювальною модифікацією. Таблиця 2 Дія Л-2102 на інтенсивність ФР сироватки крові на 60 добу спостереження Спектри збудження (нм) Група спостереження, M±m (DL50) Контроль (n=10) 1/10 (n=10) 1/100 (n=10) 1/1000 (n=10) 297 4270,6±35,2 6535,8±41,5* 5392,6±38,7* 4940,3±35,8* 313 3215,4±27,3 5997,3±32,4* 4898,3±25,6* 3810,7±29,3* 334 627,8±18,5 1240,6±20,7* 1124,7±22,8* 925,4±18,9* 365 1868,4±29,4 2684,5±22,3* 2497,3±27,2* 2205,3±27,4* 404 412,3±11,7 1368,6±14,5* 1292,6±20,7* 971,5±18,6* 434 614,8±16,5 1287,2±21,3* 1159,7±18,4* 980,6±16,3* При цьому, як і в разі з Л-303 (у прототипі), особливо значне підвищення інтенсивності ФР 10 відносно контрольної групи спостерігалося при довжинах хвиль збудження 404 нм (у 3,3; 3,1 й 2,4 разу) і 434 нм (у 2,1; 1,9 та 1,6 разу) у результаті впливу 1/10, 1/100 й 1/1000 DL50 Л-2102 відповідно. Крім того, по закінченні експерименту було встановлено й зниження текучості цитоплазматичних мембранах лімфоцитів (у 2,3 та 1,8 разу в білок-ліпідних контактах і в 2,1 й 15 1,6 разу в ліпідному бішарі) та еритроцитів (у 2,1 й 1,6 разу в білок-ліпідних контактах і в 1,9 та 1,7 рази в ліпідному бішарі) у разі дії 1/10 й 1/100 DL50 досліджуваного ксенобіотика відповідно (табл. 3). Таблиця 3 Вплив Л-2102 на текучість мембран клітин крові (коефіцієнт ексимеризації пірену (λ випромінювання - 470 нм/λ випромінювання - 393 нм) в умовах тривалої токсифікації Група тварин, доза Показники, М±m Лімфоцити Еритроцити Білок-ліпідні контакти Ліпідний бішар Білок-ліпідні контакти Ліпідний бішар Контроль (n=10) 3,78±0,26 3,60±0,23 2,86±0,14 2,82±0,17 1/10 (n=10) 1,65±0,18* 1,73±0,26* 1,35±0,09* 1,48±0,06* 1/100 (n=10) 2,13±0,14* 2,20±0,19* 1,83±0,07* 1,67±0,13* UA 116919 C2 4 Нарешті, мала місце й активація окислювальної модифікації білків цитоплазматичних мембран лімфоцитів та еритроцитів при дії досліджуваного ксенобіотика, зокрема 1/10 й 1/100 його DL50, що підтверджувалося зростанням у сироватці крові рівнів 2,4- дтнітрофенілальдогідразонів (2,4-ДНФАГ) (у 2,9 та 1,9 рази) і 2,4-дінітрофенілкетогідразонів 5 (2,4-ДНФКГ) (у 2,7 та 1,8 рази відповідно) (табл. 4). Таблиця 4 Дія Л-2102 на окислювальну модифікацію білків на 60 добу токсифікації Показники Група спостереження, DL50 (M±m) Контроль (n=10) 1/10 (n=10) 1/100(n=10) 2,4-ДНФАГ, д. опт. щільн./г білка, λ=370 нм 23,52±1,74 68,35±3,96* 44,18±2,66* 2,4-ДНФКГ, од. опт. щільн./г білка, λ=380 нм 27,35±1,86 74,82±3,85* 49,23±3,17* Отже, вищезазначені дані свідчать про суттєві ушкодження як ліпідних, так і білкових структур плазматичних мембрані під впливом такого ксенобіотика, як Л-2102, причому, не тільки 10 1/100 його DL50, а й ще більше - 1/10 DL50, а стосовно деяких показників - навіть 1/1000 DL50· Оскільки ж відомо, що досліджуваний ксенобіотик відноситься до неіоногенних поверхнево- активних речовин, імовірність його впливу на ліпідні компоненти мембран є дуже високою. У цьому зв'язку було додатково проведено визначення вмісту фракцій ФЛ у мембранах еритроцитів, лейкоцитів і гепатоцитів на 60 добу дії Л-2102, зокрема 1/100 його DL50, як 15 загальноприйнятої. Дослідження виявили суттєві порушення рівня ФЛ у мембранах клітин крові й печінки. Так, вплив ксенобіотика супроводжувався зниженням вмісту ФЕА (в 1,39-1,58; 1,48- 1,75 та 1,32-1,58 рази), СМ (в 1,27-1,50; 1,43-1,65 та 1,50-1,74 рази), ФС (в 1,51-1,75; 1,18-1,40 та 1,27-1,51 рази) і ФІ (в 1,64-1,91; 1,81-2,20 та 1,77-2,22 рази), а також підвищенням рівня ФХ (в 1,34-1,46; 1,46-1,64 та 1,50-1,64 рази), ЛФЕА (у 2,88-3,65; 2,30-3,90 і 2,73-3,35 рази), ЛФХ (у 20 2,45-3,15; 3,10-3,70 і 2,92-3,80 рази) і КЛ (в 1,68-1,84; 1,29-1,44 та 1,59-1,77 рази) в еритроцитах, лейкоцитах і гепатоцитах відповідно (табл. 5). Таблиця 5 Вплив Л-2102 в 1/100 його DL50 на фосфоліпідний склад мембран еритроцитів, лейкоцитів і гепатоцитів щурів при тривалій токсифікації (%) Показники Контрольна група (M±m), n=10 Дослідна група (М±m), n=10 еритроцити Лейкоцити Гепатоцити Еритроцити Лейкоцити Гепатоцити ФЕА 21,3±1,53 24,5±1,83 23,62±1,75 14,4±0,96* 15,3±1,27* 16,4±1,45* ФХ 41,3±1,72 38,6±1,61 38,7±1,42 57,8±2,53* 59,8±3,34* 60,7±2,73* CM 14,4±1,26 17,3±1,52 15,8±1,16 10,5±0,88* 11,3±0,82* 9,8±0,74* ФС 11,5±0,84 9,3±0,73 9,82±0,87 7,1±0,54* 7,25±0,63* 7,12±0,63* ЛФЕА 1,2±0,42 1,41±0,21 1,43±0,65 3,92±0,46* 3,67±0,42* 4,35±0,44* ЛФХ 1,5±0,33 1,22±0,04 1,27±0,08 4,2±0,52* 4,15±0,37* 4,27±0,56* ФІ 6,2±0,73 7,2±0,68 7,54±0,86 3,51±0,27* 3,62±0,35* 3,82±0,43* КЛ 0,5±0,08 0,63±0,06 0,56±0,04 0,88±0,04* 0,86±0,05* 0,94±0,05* До того ж, дослідження показали, що тривала субтоксична дія Л-2102 супроводжується 25 глибокими порушеннями й фізико-хімічних властивостей мембран, зокрема їх іонної проникності. Так, на 60 добу експерименту 1/10 й 1/100 DL50 ксенобіотика підвищували самовільний та індукований валіноміцином вихід іонів K + з еритроцитів, а також сумарну кількість цих іонів на 1 млн останніх у порівнянні з групою контролю (табл. 6). Було встановлено, що більш інтенсивно Л-2102 впливає на самовільний вихід іонів K + з еритроцитів (у 10,96-12,63 і 30 9,74-11,52 рази), а ніж індукований валіноміцином (у 2,34-2,78 та 1,90-2,28 рази) і сумарну кількість даних іонів на 1 млн клітин (у 4,69-5,31 й 4,07-4,73 рази відповідно). UA 116919 C2 5 Таблиця 6 Дія Л-2102 на самовільний та індукований валіноміцином вихід іонів K + з еритроцитів (млн/хв) Група тварин, доза Швидкість самовільного виходу К + з еритроцитів Швидкість індукованого валіноміцином виходу К + Сумарна кількість іонів K + на 1 млн еритроцитів Контроль 0,54±0,02 6,75±0,34 18,73±1,68 1/10 (n=10) 6,37±0,45* 17,28±1,47* 93,65±5,82* 1/100 (n=10) 5,74±0,48* 14,10±1,26* 82,46±6,17* Виходить, що показник іонної проникності мембран є дуже чутливим при дослідженні їх функцій. Якщо порівняти зсуви досліджуваних показників, які використовувались і в прототипі, з такими, що додатково запропоновані в заявленому способі, то виходить, що для БХЛ вони 5 становили в середньому максимум 2,8 рази, для ФР - 3,3 рази, для текучості - 2,3 рази й для окислювальної модифікації білків - 2,9 рази, у той час як для вмісту ФЛ - 3,4 рази, а для іонної проникності - 11,8 разу! Тобто, додаткові показники заявленого способу можуть розглядатися в якості досить інформативних маркерів, які віддзеркалюють стан структури й функції цитоплазматичних мембран, що дозволяє рекомендувати їх застосовування в діагностиці 10 донозологічних і патологічних станів. Отже, отримані дані свідчать, що додаткове використання показників у заявленому способі дозволяє більш об'єктивно судити як про розвиток молекулярної мембранної патології (на підставі констатації й зсувів вмісту ФЛ), так і порушення фізико-хімічних властивостей цитоплазматичних мембран (на підставі констатації й змін іонної проникності), що дозволяє 15 вважати перспективним заявлений спосіб діагностики структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран для широкого використання не тільки в експериментальній, а й в практичній медицині. Таким чином, заявлений спосіб діагностики структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран має суттєві переваги стосовно прототипу. Він сприяє більш високій 20 інформативності щодо виявлення порушення як структури, так і функцій мембран, не потребує дефіцитних або дорогих реактивів та обладнання, а тому є корисним для медицини й може бути рекомендований для широкого впровадження в практику роботи як експериментаторів і науковців, так і лікарів-лаборантів з метою більш об'єктивної констатації наявності патологічних і донозологічних станів у людини, зокрема в умовах тривалої субтоксичної дії на неї 25 ксенобіотиків, а тому й своєчасного надання їй відповідної медичної допомоги. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб діагностики структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран сироватки 30 крові й гомогенатів тканин щурів популяції Вістар на 45 добу токсифікації їх 1/100 середньолетальної дози (DL50) ксенобіотика Лапролу 303, що включає проведення біохемілюмінесцентних і фосфоресцентних досліджень біологічного матеріалу та оцінку наявності пошкодження ліпідно-білкового шару мембран на основі змін співвідношення інтенсивності спалаху світіння й кінетики реакції, який відрізняється тим, що визначають 35 інтенсивність спонтанної хемілюмінесценції (СХЛ), індукованої FeCl3 хемілюмінесценції (FeCl3- ІХЛ), люмінол-залежної й індукованої FeCl3 хемілюмінесценції (ЛЗ FeCl3-ІХЛ) сироватки крові щурів на 30 й 60 добу дії на них 1/10, 1/100 й 1/1000 DL50 поліоксипропіленгліколю з молекулярною масою 2100 й товарною назвою "Лапрол" (Л-2102), інтенсивність фосфоресценції (ФР) сироватки, текучість цитоплазматичних мембран еритроцитів і 40 лімфоцитів, окислювальну модифікацію білків мембран даних клітин на 60 добу впливу 1/10 й 1/100 DL50 цього ксенобіотика й додатково відсотковий вміст фосфатидилетаноламіну (ФЕА), сфінгомієліну (CM), фосфатидилінозитолу (ФІ), фосфатидилсерину (ФС), фосфатидилхоліну (ФХ), лізофосфатидилетаноламіну (ЛФЕА), лізофосфатидилхоліну (ЛФХ) і кардіоліпину (КЛ) у мембранах еритроцитів, лімфоцитів і гепатоцитів на 60 добу токсифікації тварин 1/100 DL50 Л-45 2102, а також іонну проникність мембран еритроцитів (швидкість самовільного й індукованого валіноміцином виходу іонів K + з даних клітин, сумарну кількість цих іонів на 1 млн останніх) на 60 добу дії на щурів 1/10 й 1/100 DL50 ксенобіотика, що об'єктивізує наявність порушення складу й властивостей цитоплазматичних мембран, зокрема у разі зниження вмісту ФЕА в 1,58-1,39; 1,75-1,48 та 1,58-1,32 разу, CM в 1,50-1,27; 1,65-1,43 та 1,74-1,50 разу, ФС в 1,75-1,51; 1,40-1,18 50 та 1,51-1,27 разу й ФІ в 1,91-1,64; 2,20-1,81 й 2,22-1,77 разу, збільшення рівня ФХ в 1,34-1,46; UA 116919 C2 6 1,46-1,64 та 1,50-1,64 разу, ЛФЕА у 2,88-3,65; 2,30-2,90 і 2,73-3,35 разу, ЛФХ у 2,45-3,15; 3,10- 3,70 і 2,92-3,80 разу й КЛ в 1,68-1,84; 1,29-1,44 й 1,59-1,77 разу в еритроцитах, лейкоцитах і гепатоцитах відповідно, а також швидкості самовільного (у 10,96-12,63 і 9,74-11,52 рази) та індукованого валіноміцином виходу іонів K + з еритроцитів (у 2,34-2,78 та 1,90-2,28 рази) і сумарної кількості даних іонів на 1 млн останніх (у 4,69-5,31 й 4,07-4,73 рази) під впливом 1/10 й 5 1/100 DL50 Л-2102, відповідно. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601