УДК 575.21/.22:576.311.347 МІТОХОНДРІАЛЬНІ ХВОРОБИ: ВЗАЄМОВІДНОСИНИ ФЕНО- ТА ГЕНОТИПУ. РЕЗУЛЬТАТИ БАГАТОРІЧНОГО ПРОЕКТУ О.Я. Гречаніна, Ю.Б.Гречаніна, Л.В.Молодан, О.П.Здибська, С.В. Білецька, В.А. Гусар, О.Ю. Вернігор, Д.В. Олійник Харківський міжобласний спеціалізований медико-генетичний центр – центр рідкісних (орфанних) захворювань Український інститут клінічної генетики ХНМУ, Кафедра медичної генетики ХНМУ Резюме: У статті представлений досвід популяційної та індивідуальної діагностики мітохондріальних дисфункцій. Обстежено 1695 випадків МТХД у дітей та 335 дорослих. Проаналізовано клінічні поліморфні ознаки при різних нозологічних формах мітохондріальної дисфункції на прикладі трьох складних випадків мітохондріальної хвороби. Показана на основі аналізу генів асоційованих із синдромом Лея, Альперса і MELAS генетична гетерогенність захворювання. Відзначено перекриття симптомів при різних варіантах МТХД. Підкреслена наявність однакової мутації при різних мітохондріальних захворюваннях - феномен, який до сих пір не знайшов пояснення. Висловлено припущення, що залучення різних варіантів генних мутацій до формування фенотипу є відображенням гено-моногенної природи захворювання. Ретельний клініко-генетичний та молекулярно-генетичний пошук варіантів при використані сучасних тонких біохімічних технологій – найбільш реальний шлях пошуку мішені ураження, який дозволить застосовувати патогенетичне лікування. Вступ. Мітохондріальні дисфункції (МТХД) серед усіх метаболічних порушень займають особливе місце не тільки за рахунок зростаючого збільшення частоти та відсутності специфічного лікування із високим ризиком успадкування, але, перш за все, тому, що порушення мітохондріального енергетичного обміну залучає за висловом Johannes A.Mayr [15] «…любий симптом, любий орган або тканину, любий вік та любу модель успадкування». Особливі ознаки МТХД, за свідченням автора, характеризуються успадкуванням від ооцита, випадковою сегрегацією мутацій в зародкових лініях, різною кількістю копій в одній клітині, незалежною реплікацією клітинного циклу, кількісними мутаціями (деплеціями), гетероплазмією (дикий тип і мутації), поступовим впливом мутацій, пороговим ефектом, підвищеним ступенем мутацій. Мітохондріальна ДНК (мтДНК) уявляє собою геном клітинних органел. Ці органели мають ендосимбіотичне походження, що обумовлює напів автономне існування генетичної системи мітоходрій. Так, синтез ДНК в мітохондріях проходить незалежно від синтезу ДНК ядерного, а успадкування цієї цитоплазматичної генетичної структури- мітохондріальної хромосоми- відбувається в нормі за материнською лінією. Це дало підставу умовно виділити сукупність мітохондріальних генів та інших фрагментів мтДНК в окремий мітохондріальний генофонд [12,13]. Встановлено, що більшість білків мітохондрій кодується клітинною ДНК, синтезується в цитоплазмі і тільки потім транспортується в мітохондрії. Саме тому мітохондріальна дисфункція може бути результатом мутацій як в мітохондріальному, так і в ядерному геномі, що потенційно збільшує кількість нозологічних форм мітохондріальної патології і потребує подолання тяжкого шляху диференційної діагностики. Мітохондріальний геном відрізняє максимальна структурна компактність при максимальній інформаційній завантаженості. Вона сформувалась завдяки змінам генетичного коду МТХ, які дозволили скоротити необхідний для транскрипції набір тРНК. МТХ змінила свій код, на думку A.Bender, за рахунок того, що амінокислота метіонін в процесі еволюції накопичилась у білках дихального ланцюга мітохондрій і виступила в ролі природного антиоксиданту [14]. Для здійснення цього процесу МТХ змінила свій код за рахунок відсутності інтронів, мінімізації набору тРНК, зменшення розмірів рРНК, відсутності спейсерних ділянок та кодування термінуючих кодонів [1, 8, 26]. В теперішній час визначення поняття МТХД стало однозначним: мітохондріальні хвороби це гетерогенна група захворювань, обумовлених генетичними, структурними, біохімічними дефектами мітохондрій і порушенням тканинного дихання, а мітохондріальні дисфункції – це функціональні порушення роботи мітохондрій. Дослідження мітохондріальних захворювань стало для ХМСМГЦ-ЦР(О)З актуальною проблемою з 1992 року, коли до Центру звернулась пацієнтка із тотальною м’язовою гіпотонією. Мати із інцестного шлюбу, у якої трьохрічна дитина була нерухомою із перших днів народження до трьох років життя на тлі нормального психофізичного розвитку. Після трьох років дитина нормально розвивається, а мати, яка сама мала таку ж нерухомість до 3-х років, занепокоєна високим ризиком для майбутніх дітей. Саме цей випадок став мотивацією розпочати багаторічний проект по вивченню проблем мітохондріальних дисфункцій в сім’ї і в популяції. Участь в міжнародному проекті JNTAS разом із Естонським біоцентром (Рихард Вилемс), Пенсильванским Університетом (професори Т. Шурр та С. Жаданов), Техаським університетом (професор Р.Маталон) дозволила провести оцінку різноманітності гаплотипів мітохондриальної ДНК населення України [4, 5, 6, 10, 16, 17, 24]. В процесі виконання цих досліджень збудована медіанна мережа, яка відображає філогенетичні відносини гаплотипів мтДНК у популяції українців, оцінено вплив популяційних поліморфізмів (мал. 1). У вибірці пацієнтів виявлено додаткові поліморфізми (генетичний фон) в гаплогрупах U5, T, X, які можуть відігравати важливу роль в проявах мітохондріальних захворювань (мал. 2). Клінічний Клінічний маршрут маршрут пацієнта пацієнта із із мітохондріальною мітохондріальною дисфункцією дисфункцією Реєстратура Медсестра: -оформленняпаспортноїчастинигенетичноїкарти; описскарг; -складанняродоводу; -вимірюваннязросту, ваги, температуритіла, артеріальноготиску. Обстеження Прийомлікаря: -сомато-генетичнедослідження. анамнезхвороби; -анамнезжиття; -оглядпробандаічленівсім'ї; -клініко-генеалогічнийаналіз; Базовеобстеження: біохімічне: -визначеннялактату; -визначеннярівняЛДГ, КФК, глюкози; Оглядфахівців: (запоказанням) -окуліста; -ортопеда; -невропатолога; -онколога; -кардіохірурга; -терапевта; -ендокринолога. Додатковеобстеження(за показаннями): -визначенняінфекції; -ТШХвуглеводівдобовоїсечі; -урінолізіс; -оксипроліну; -електролітикрові; амінокислотикрові -газовахроматографіяімасспектрометрія Мал.1 Медіанна мережа, яка відображає філогенетичні відносини гаплотипів в мтДНК у популяції українців. Отримані дані свідчили про генетичні особливості мтДНК в сучасних українських популяціях, а також обґрунтували необхідність їх обліку для ефективного прогнозування, діагностики і профілактики моногенної і мультифакторіальної патології, асоційованої з функціональною недостатністю мітохондрій Мал.2. Медіанна мережа, яка відображає філогенетичні відносини гаплотипів в мтДНК у вибірці пацієнтів з клінічно встановленою мітохондріальною дисфункцією. Розрахунок частот гаплотипів у вибірці пацієнтів з клінічно встановленою мітохондріальною патологією продемонстрував наявність євроспецифічних гаплогрупп: H, pre-V, V, J, T, U, I, W і X, сумарна частота яких склала 86,0%. Азіатські гаплогрупи (А і C) виявлені з частотою 4,0%. Показана висока частота гаплогрупп U5 (14,0%), Т (16,0%) і Х (8,0%) в досліджуваній вибірці, в порівнянні з контрольною, яка, ймовірно, обумовлена гіперваріабельними позиціями 16189 і 16294, що містяться в основних нуклеотидних мотивах відповідних гаплогруп [16, 17, 23]. Були розраховані показники генетичного різноманіття (D та θπ) у вибірках, які склали 0,992±0,0019 и 5,19; 0,990±0,007 и 6,13, відповідно. Рівні показників свідчили про високу генетичну гетерогенність та наявність фіно-угорского та германського субстратів, що, скоріше за все, зумовлене впливом процесів метисації та асиміляції. Встановлена схожість із генофондами західних та північних слов'ян [23]. Визначені поліморфізми в генах тРНКlys и тРНКleu кодуючого регіону мтДНК у вибірці пацієнтів із клінічно встановленою мітохондріальною патологією. Виявлена 21 гомоплазмічна позиція (13 синонимічних и 8 несинонимічних). Знайдені мутації у пацієнтів із типами ГВС I мтДНК, котрі визначають гаплогрупи Н (14553С/Т Val→ileND6) и Х (12706CPhe→leuND5). Отримані результати дозволили припустити вплив популяційного генетичного фону на інтенсивність мутаційних процесів і фенотипічну експресію захворювання. Паралельно із цим напрямком досліджень було проведено популяційне дослідження частоти поліморфних варіантів генів ферментів фолатно-метіонінового циклу разом із проф. Р. Маталоном (США, Техаський університет). Отримані результати досліджень деяких популяційних особливостей привели до необхідності вивчення впливу поліморфізмів мтДНК та поліморфних варіантів генів С677T MTHFR, А66G MTRR, на клінічні прояви мітохондріальної дисфункції [1, 8, 9, 10]. Метою цього етапу роботи була розробка нового напрямку вивчення фундаментальних і прикладних проблем клінічного поліморфізму і генетичної гетерогенності мітохондріальної дисфункції, пов’язаної із складною взаємодією популяційно-генетичних факторів, що здатні сформувати схильність до порушень енергетичного обміну на тлі зміненого епігенетичного статусу. Концепція дослідження, яка підлягала доказу торкалась положення: вплив поліморфізмів мтДНК на вираженість МТХД відбувається внаслідок патологічного трансформування поліморфізмів мтДНК на тлі зміненого статусу метилування як головного модифікатора генома та наявності тригеру [1]. Були проведені молекулярно-генетичні дослідження, визначені частоти МТХД у структурі спадкових синдромів, вивчені клініко-генетичні особливості МТХД, патогенетичні механізми мітохондріальних енергетичних порушень; створений діагностичний алгоритм для проведення генетичного скринінгу МТХД у досліджуваній популяції [1, 8, 9, 10]. Відмічене найчастіше включення в патологічний процес органів і систем при поліморфізмах мтДНК тРНК – лізін: 8697G/A; 8860G; 8701G/А; 8856G/А; 8860А (CRS); 8251G/А; 8472С/Т; 8448Т/С; 8994G/А; 8337Т/С; 8794С/Т; 8584G/А; 8701А/G та при амінокислотній заміні тРНК-лізін (syn, thr/ala, pro/leu, met/val, met/thr, his/tyr, ala/thr) при цьому енцефалопатії частіше були асоційовані із поліморфізмом тРНК-лізін та новими мутаціями тРНК-лейцин (3624 А/G; 3594С/Т; 3705G/А; 3505А/G; 3552Т/А). Ураження м’язової, травної, офтальмологічної, серцево-судинної, ендокринної системи частіше було асоційовано з поліморфізмами тРНК-лізін. Ці данні доводять клінічну значущість поліморфізмів мтДНК, як негативних мутацій у формуванні клінічних ознак МТХД. Нами наведені фенотипи мітохондріальних хвороб мітохондріального походження, які підтвердили необхідність подальшого вивчення мітохондріального геному (мал.3). Мал. 3. Мітохондріальна хвороба. Просеквенований ген т-РНК- лізин. Знайдені мутації 8836A/G (met/val), 8472C/T(pro/leu2), 8614T/C Мітохондріальна хвороба. Просеквенований ген т-РНК- лейцин. Знайдені мутації 3624A/G,3705G/A Мітохондріальна хвороба. Проведений повний сиквенс мтДНК. Знайдені мутації 1888G/A, 2706A/G, 8697G/A, 8860G(thr/ala), 11251A/G, 11719G/A,11812A/G, 14687A/G, 14766C/T, 14905G/A, 15326A/G, 15452C/A, 15607A/G, 15928G/A. Клініко-генетичний, молекулярно-генетичний, математико-статистичний аналіз пацієнтів із МТХД, асоційованих із точковими мутаціями мтДНК і певними синдромами встановив у 82,67% хворих важке ураження ЦНС, сечовидільної системи (у 76,0 %), травної (у 84,0%), нервової системи (у 88,0%), підшкірної клітковини (у 53,33%), хребта (у 52,0 %), обличчя (гіпомімія) (у 64,0%), що свідчить про достовірність діагностики, з одного боку, а з другого, про ймовірність залучення в патогенез МТХД не тільки специфічних для синдрому мутацій, а і генетичного оточення. Так, при знайденій новій мутації 12706С гена ND5 в тканині мозку (клінічний випадок хвороби Лея) були присутні мутації F124L і Е145GND5, які змінили, скоріш за все, функціонально важливі сайти, які залучені в перенос протонів, і привели до зміни протонного каналу і значно вплинули на фенотип синдрому Лея, і ймовірно, стали причиною мутацій в зародкових клітинах матері. Розроблений на підставі отриманих даних континуум клінічних ознак МТХД, клінічний маршрут пацієнта з МТХД, алгоритм діагностики МТХД та схема комплексного лікування дозволили підвищити ефективність діагностики до 93% і отримати стабільну ремісію у значної кількості пацієнтів із МТХД (мал. 4,5,6.) [1]. Мал.4. Клінічний Клінічний маршрут маршрут лікаря лікаря та та пацієнта пацієнта із із мітохондріальною мітохондріальною дисфункцією дисфункцією Повторнийоглядпацієнта ізрезультатамиобстеження Консультація Експертної Ради Консультаціяведучого експерта Сіндромологічний аналіз Попереднійдіагноз Бесідазпацієнтамипро попереднійдіагнозта планобстеження Остаточнийдіагнозіз призначеннямлікування Диспансернеспостереженняза родиноюзмітохондріальної дисфункцією Профілактикамітохондріальної дисфункціївсім'ї: -преконцепційнапідготовка; -пренатальнадіагностика. Мал.5 СІНДРОМОЛОГІЧНИЙАНАЛІЗ Специфічнийфенотип мітохондріальноїхвороби Неспецифічнийфенотипз мітохондріальнимкомпонентом молекулярне дослідження біохімічне дослідження біопсіяскелетних м'язів Мутації мтДНК мутації ядерноїДНК тактак ні ні сечакров RRF- феномен є RRF- феномена нема ↑органичні кислоти, кетонурія ↑ацилкарнітіни, лактатацидоз, гіпо/гіперглікемія, ↑КФК, ЛДГ, АСТ, АЛТ Первинна мітохондропатія Органична ацидурія дослідження мтДНК Вторинна мітохондропатія Алгоритм Алгоритм діагностики діагностики мітохондріальних мітохондріальних хвороб хвороб Мал. 6 Проведене дослідження довело вплив поліморфізмів мтДНК на експресію МТХД, які відбуваються внаслідок заміни їхньої адаптивної ролі на патогенну на тлі зміненого метилювання як основного модифікатора геному внаслідок порушення функції фолатного циклу та наявності певних тригерів, що вказує шлях до ранньої діагностики і адекватної корекції МТХД [1, 7]. Два попередні етапи досліджень визначили, що мітохондріальному енергетичному обміну притаманні загальні генетичні особливості - генетична гетерогенність проявів і клінічний поліморфізм. Ці якості забезпечуються великою кількістю залучених реакцій, залученностю двох геномів - ядерного і мітохондріального, та наявністю тканиноспецифічних та індивідуальних проявів. Накопичений у світі досвід свідчив про те, що існують різні прояви мітохондріальних порушень, які демонструють системний характер. Так, міопатичний синдром проявляється у вигляді м’язової слабкості, гіпотонії та атрофічних процесів; міалгії, зниження толерантності до фізичних навантажень. Ураження центральної і периферичної нервової системи включає респіраторний дистрес-синдром, порушення психомоторного розвитку, судоми, атаксію, пірамідні розлади, порушення офтальмологічної системи (зовнішня офтальмоплегія та ін.), полінейропатію. Ураження печінки складають: прогресуюча гепатомегалія, фіброз печінки, явища печінкової недостатності. Ураження серця найчастіше проявляється кардіоміопатією. Зміни з боку нефроуринарної системи характеризуються тріадою Фанконі (фосфатурія, глюкозурія, аміноацидурія), а ендокринні порушення- затримкою росту і гіпоглікемією, ураженням слуху- нейросенсорною глухотою. Ураження зору проявляється атрофією зорових нервів, пігментною дегенерацією сітківки, катарактою, а порушення шлунково-кишкового тракту- повторною блювотою та діареєю, хронічним прогресуючим панкреатитом. Такий поліморфізм проявів довів необхідність більш глибокого вивчення клініко-генетичних характеристик МТХД. Нами використаний діагностичний каскад [15], що дозволяє оцінити загальні симптоми МТХД. Діагностичний каскад Підозрювані симптоми Синдроми Залученіоргани Метаболіти Ергометрія, навантажувальнітести Дослідженнязалученихорганів Біопсія ЕргометріяМорфологія Молекулярнагенетика мтДНК, нуклеарнігени Мал. 9 Діагностичний каскад Такі зміни з боку різних органів і систем при МТХД супроводжуються значними морфологічними проявами - проліферацією мітохондрій, поліморфізмом мітохондрій з порушенням форми і розмірів, дезорганізацією крист, скупченням аномальних мітохондрій під сарколемою, пара кристалічними включеннями мітохондрій, наявністю міжфібрілярних вакуолів. В період виконання проекту мітохондріальні дисфункції встановлені нами у 1695 дітей та 335 дорослих (табл.1). Таблиця 1 Деякінозологічніформи, якізустрілисявХСМГЦза 10 років(2007 -2017) Періодчасу Код200 7 200820092010201220132014201520162017За10 лет Нозологія: діти/дорос лі Леясиндром G31. 8 1/-2/-3/- Мітохондріальна хвороба,неуточнена G71. 3 16/111/75/-4/-2/-4/11/151/13 MNGIE синдром G71. 3 -/1-/2-/3-/1 -/14/11 MELAS синдром G71. 3 1/-1/36/21/-2/-1/-2/-16/10 MERRF синдром G71. 3 4/1 Кернса-Сейра синдром G71. 3 1/-3/-1/-2/-1/-14/2 Мітохондріальна хвороба,інфантильна, летальна G71. 3 1/-1/- Мітохондріальна дисфункція G71. 3 4/312/8 38/1 2 30/3 87/2 4 266/ 33 165/ 50 183/ 36 391/ 62 464/ 60 1695/335 НейропатіяЛебераH47.2-/1 1/4 Задля розуміння патогенетичних механізмів формування клінічних ознак МТХД, ранньої діагностики і профілактики захворювань, проведено співставлені фено- та генотипічні характеристики МТХД на прикладі як найбільш поширених серед МТХД та раритетних синдромів. Серед них - синдром Лея, MNGLE-синдром, MELAS-синдром, MERRF-синдром, мітохондріальна хвороба, інфантильна, летальна; нейропатія Лебера, синдром Альперса. При проведенні уточнюючої діагностики ми аналізували описані в Genetics Home Reference (ghr.nlm.nih.gov) гени та їхні мутації, щоб через розуміння механізмів дії генних мутацій в кожному випадку наблизитись до доказової терапії. Так, при синдромі Лея ми проаналізували 32 гени, які зустрілись при різних варіантах синдрому. Серед них - AIFM1, C12orf65, DLAT-ген, ECHS1, FARS2, FBXL4, GFM2, GTPBP3, HIBCH, IARS2, LIPT1, LRPPRC, MT-ATP6, MT-CO3, MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5, MT-ND6, MT-TK, MT-TL1, MT-TV, MT-TW, MTFMT, NARS2, NDUFA9, NDUFA10 , NDUFA11, NDUFA12, NDUFAF6, PDHB, PNPT1, TPK1, SCO2, SERAC1, SUCLG1, TTC19, UQCRQ. Ген МТ-ND1 кодує інформацію для синтезу NADH-дегідрогенази1- частини великого ферментного комплексу - комплексу 1. Цей комплекс забезпечує перенесення електронів із молекули NADH в убіхінон. Енергія для синтеза АТФ створюється внаслідок проходження убіхінону через інші комплекси. Ця мутація несе відповідальність за багато мітохондріальних хвороб, в тому числі за 13% нейропатій Лебера (63460А) з тяжким перебігом. В той же час, 20 - 40% пацієнтів з порушенням зору, які мають цю мутацію, з віком набувають нормального зору. Інколи ця мутація поєднується із синдромом MELAS (енцефаломіопатія, лактат-ацидоз та інсульто-подібні стани). У 5 осіб знайдена ця мутація, яка впливала на активність комплексу 1 та виробництво енергії. Але до сих пір ще не встановлено як зміни в МТ-ND1 гені призводять до специфічних ознак синдрому MELAS. Ген МТ-ND2 асоційований із спадковою оптичною нейропатією Лебера (LHON) - гострій або підгострій втраті зору внаслідок дисфункції зорового нерву. У деяких пацієнтів відмічаються дефекти серцевої проводимості у поєднанні із неврологічними ознаками. Встановлено (МІМ535000), що LHON є наслідком первинної мутації мітохондріальної ДНК. Ген МТ-NDЗ кодує головну субодиницю мітохондріальної мембрани дихального ланцюга NАDН-дегідрогенази (комплекс 1), який функціонує при перенесені електронів із NАDН в дихальний ланцюг. В якості термінового акцептора електронів для фермента виступає убіхінон. Дефіцит комплексу 1 є дуже важливим для організму, саме тому його недостатність небезпечна, а спектр порушень багатоплановий як по віку маніфестації, так і по клінічним проявам. Фенотипи носіїв цієї мутації різні і вони складаються із макроцефалії із прогресуючою лейкодистрофією, неспецифічною кардіоміопатією, ураженням печінки, синдромами Лея, Лебера, Паркінсона. Наведені нижче клінічні випадки показали необхідність використання при уточнюючій діагностиці МТХД комплексного трьохрівневого обстеження, бо саме клініко-генетичні, параклінічні, біохімічні та молекулярно-генетичні методи дозволяють наблизитись до патогенетичного лікування Клінічний випадок 1: Пацієнт М-н. Синдром Лея Клінічні ознаки: занепокоєння дитини, розвиток з незначною затримкою, зростання симптоматики з 1 року 8 місяців після перенесеної інфекції: косоокість, плоско-вальгусна деформація стоп, невпевненість ходи, синдром рухових порушень, затримка мовного розвитку, спастичний трипарез, дизартрія, когнітивна недостатність. На момент звернення дитини в 3 роки: часті поперхування, порушення сну, немотивована посмішка, підвищене потовиділення. Фенотип: мармуровість шкірних покровів, поодинокі невуси, жорстке, темне волосся, сінофріз, довгі вії (національна особливість фенотипу), периорбітальні тіні, немотивована посмішка, косоокість, що розходиться, недостатньо розвинений підшкірно-жировий шар, деформація грудної клітини. Інструментальні дослідження: УЗД: реактивні зміни паренхіми печінки, помірна гепатомегалія; УЗД нирок: піелектазія зліва. При ЕНМГ - ознаки грубого порушення проведення по кортико-спинальним трактам. За даними МРТ головного мозку: на рівні базальних ядер симетричні зони змінення МР-сигналу (за рахунок геморагії або високого вмісту білка), вогнище високого сигналу та ділянки низького сигналу (ознаки ішемії). Мр-картина структурних змін в проекції базальних ядр з обох сторін і субепендимарно тілу лівого бокового шлуночка, більш імовірно, за рахунок метаболічної (мітохондріальної) енцефалопатії з ураженням підкіркової сірої речовини. Не можна виключити цитомегаловірусну інфекцію. Кіста прозорої перетинки. МРТ з негативною динамікою. Лабораторні показники: лактат ↑; співвідношення лактат/піруват ↑ 22,6 (норма до 20); амінокислоти крові: ↑ триптофан, ↑ аргінін, ↑ лейцин, ↑ лізин, ↑ а-аміномаслянна кислота; MTHFR 677CC (нормальна гомозигота); MTRR 66 AG (Гетерозигота); MTR 2756 AA (нормальна гомозигота); В9 (норма); В12 (норма); біохімічний аналіз крові: ↑ загальний холестерин; мікроелементи: ↓ цинк, ↓ мідь; вірусологічне дослідження: виявлено вірус Епштейна-Барр; М'язова біопсія: мінімальні мітохондріальні аномалії (мал.7, 8). - Спектроскопічний аналіз комплексів дихального ланцюга (2014р): мітохондріальна активність дихального ланцюга в нормі. Незначно знижена лактатдегідрогеназа. Мал. 7 Хворий Г. цитохром40х ed зниження активності мітохондріальних ферментів Мал. 8. цитохром40х ed зниження активності мітохондріальних ферментів Встановлено діагноз: Синдром Лея зі спино-мозковим ураженням​​(мутація m.14487T>C гена MT-ND6, присутня в гетероплазмічному стані зі значенням 88% і прогнозуюча протеїнові зміни pMtt63Val) (рис. 8) "Сангер» секвенування: виявлена патогенна мутація в мітохондріальному геномі (m.144887) у дитини і також у його матері Мал. 8. Розташування гена MT-ND6 на L-ланцюжку людського мітохондріального геному. MT-ND6 є одним з семи мітохондріальних генів NADH-дегідрогенази (жовті блоки). Клінічний випадок 2: Пацієнт М, 2006 р.н. Клінічні ознаки: затримка розумового розвитку, напади тоніко-клонічних судом, емоційна лабільність, розгальмування, когнитивні порушення, не завжди виконує інструкції, періодичний біль в кінцівках, ходить на носочках. Хворий з народження, народився в асфіксії в 35 тижнів —у матері пре еклампсія. В періоді раннього дитинства: до року тричі ГРВІ, анемія, гіпотрофія, затримка моторного розвитку, в 1р 8 месяцев на тлі високої температури-клонико-тонічні судоми. З 3-х рокив: слабкість в ногах, часті падіння, пірамідна недостатність. В 6,5 рокив: гострий напад блювоти, судоми, втрата свідомості, вторинна (токсична) кардіоміопатія, лямбліоз, вірус Епштейна-Барр, синдром мінімальної мозкової дисфункції, затримка психо-моторного розвитку, епісиндром. З 7 років: когнітивна епілептиформна дезінтеграція, психо-органічний синдром з інтелектуально-мнестичною недостатністю, порушення експресивної мови. Лабораторні показники: ↑ лактат; ↑ гомоцистеїн; вірусологічне обстеження- Епштейн-Барр до капсидному білку і ядерного антігену- позитивно; біохімічний аналіз крові: ↑ АСТ, ↑ сечовина, ↑ лактатдегідрогеназа, ↑ креатинкіназа; ГХ-МСС- виявлені зміни метаболітів: грибків і дріжджів, бактерій в шлунково-кишковому тракті, кісткової тканини, нейротрансмітерів, зниження триптофану, кетоза, недостатності В6, В9, коензиму Q10; ВЕРХ амінокислот крові -↓ метіонін, ↓ цистин, ↓ глютамин, ↓ цітрулін, ↓ треонін, ↓ гліцин, ↓ серін. Інструментальні дослідження: - ЕНМГ в 3 роки - змін не виявлено - МРТ головного мозку в 6,5 років- МР-ознак вогнищевого ураження паренхіми не виявлено - ЕЕГ пароксизмальний стан біоелектричної активності головного мозку - ЕХО-ЕС ознаки внутрішньочерепної гіпертензії - РЕГ-порушений венозний відтік, асиметрія кровонаповнення. - ЕКГ-порушення процесів реполяризації міокарду верхівково-бічної області - ФКГ- знижена амплітуда 1 тону , фрагментований систолічний шум - УЗД щитовидної залози-гіперплазія 1-2 ступеня - ЕХО-КГ-прото-, періодично мезосистолічний пролапс мітрального клапана 1ст, ФВ-64%, в лівому шлуночку- тонкі аберантні хорди - Рентгенографія попереково-крижового відділу хребта- перехідний попереково-крижовий хребець з явищами сакралізації, Spina bifida S1, S2. нестабільність L2-L3-L4-L5 Молекулярне дослідження: ПЛР-аналіз букального епітелію. Виявлена мутація А3243G, що обумовлює розвиток синдрому MELAS. Кількість мутантних копій в гені лейцинової тРНК складає більше 40% Можливий механізм молекулярного патогенезу, викликаний дефіцитом модифікації вобуляціі мутантних тРНК у пацієнтів MELAS. Патогенна точкова мутація (A3243G або U3271C) у мутантів tRNALeu (UUR) у пацієнтів MELAS викликає дефіцит модифікації τm5U, що призводить до дефекту трансляції UUG-кодонів [18, 19] Клінічний випадок 3: Пацієнт А. 3,5 років. Клінічні ознаки: внутрішньоутробно- слабке, рідкісне ворушіння плоду. Період новонародженості: слабкий смоктальний рефлекс. Період раннього дитинства: з 5 місяців – гіпотонія, затримка психомоторного розвитку, поперхування, полінейропатія, псевдокрипторхізм, фімоз, виражена м'язова гіпотонія, симптомокомплекс млявої дитини, гепатомегалія, криптогенний гепатит, спленомегалія, кардіоміопатія. Після перенесеного ГРВІ в 1рік 9 місяців: перестав вставати, регрес моторного розвитку. У 2 роки 2 місяці: блювоти, занепокоєння, млявість, плаксивість, зниження апетиту, відмова від їжі. У 2 роки 4 місяці: гостре порушення мозкового кровообігу в басейні правої задньої мозкової артерії, з розвитком лівобічного геміпарезу, епісиндром, регрес мовного розвитку, наростання м'язової гіпотонії, міопатія, коливання рівня глюкози від гіпер- до гіпоглікемії. У фенотипі: зниження маси тіла, світле волосся, переважання мозкового черепа над лицьовим, виступаючий лоб, відкрите велике тім'ячко, дизморфічні риси обличчя, сколіоз, мікроангіопатія долонь і підошов, кардіоміопатія, гепатоспленомегалія, м'язова гіпотрофія, м'язова гіпотонія. Лабораторні дані: - ВЕРХ амінокислот: підвищений цистин, тирозин - Коагулограма: підвищений протромбіновий індекс, підвищений АЧТЧ - Знижені рівні вітамінів В2, В9, В12 - Аміак- норма - Нейротрансмітери- норма - MTHFR 677CT; MTRR 66GG, MTR 2756AA, PAI 675 (5G\4G), лактазная недостатність 13909 С\Т - Підвищені трансамінази, креатинфосфокіназа - Глюкоза: коливання від гіпер- до гіпоглікемії - Гіпергомоцистеїнемія - Молекулярно -генетично дослідження: виключений синдром MELAS і MNGIE синдром, але виявлені дві мутації в гетерозиготному стані гена POLG1. Проведено молекулярний аналіз гена: POLG: NM 002693.2 OMIM 174763 (методом прямого нерадіоактивного секвенування підтверджено наявність раніше виявлених у пробанда мутацій c.C1760T: p.P587L і c.A2591T: p.N864I в компаунд-гетерозиготному стані (мал..9) Запідозрений синдром Альперса. У батька: виявлена мутація С.А 2591Т: п т8641 в гетерозиготному стані. У матері виявлена мутація сС1760Т ПП 587L в гетерозиготному стані. Мал.9 Нами проведена аналітична робота по вивченню групи синдромів, пов'язаних з порушенням гена POLG, які характеризовались: · Перекриванням ознак і симптомів, залученням найбільш енерготропних органів (м'язи, нервова ссітема, головний мозок) · Ген POLG, несе інструкції для створення активної частини - альфа - субодиниці білка - полімерази гама (pol γ) · Pol γ -ДНК полімераза, · Зчитує послідовності ДНК · Використовує їх як шаблони нової ДНК в процесі реплікації ДНК · ДНК полімерази відіграють критичну роль в репараціі ДНК · Pol γ єдина ДНК полімераза активна в мітохондріях, реплікує мтДНК · Найбільш часта мутація Pol γ - заміна амінокислоти аланін амінокислотою тріонін в положенні 467 (Ala467Thr або A467T). · Блокує здатність альфа-субодиниці прікріплюватись до бета-субодиниці, що знижує здатність Pol γ полімерази до синтезу ДНК. Синдром Альперса (Alpers-Huttenlocher). Причина - мутація гена POLG, супроводжується виснаженням ДНК і спостерігається тільки в тканинах - м'язів, нервової системи і головного мозку. Мутація POLG також спостерігається при: · синдромі MJRAS – мітохондріальній рецесивній атаксії; · синдромі SANDO - сенсорній атаксії, невропатії, дизартрії і офтальмоплегії; · синдромі MCHS - дитячому міоцереброгепатичному синдромі; · синдромі MEMSA - сенсорній атаксії, міоклонічній епілепсії і міопатії Наведені приклади вказують на залучення певних гілок метаболізму при МТХД, а наше прагнення знайти біохімічну мішень ушкодження для розробки адекватної терапії було мотивацією поєднання молекулярно-генетичних, клініко-генетитчних та біохімічних досліджень. Саме тому ми використали найбільш інформативну і близьку до молекулярного дослідження модель вивчення стану продуктів обміну амінокислот – органічних кислот. Уточнююча діагностика МТХД проведена нами у всіх пацієнтів із використанням оцінки біохімічного фенотипу за допомогою сучасного обладнання (ВЕРХ, тандемна мас-спетрометрія, газова хроматографія / мас-спектрометрія та інші). Біохімічний фенотип виступав як посередник між клінічним фенотипом та генотипом. Цей шлях був виправданий, бо дозволяв поєднати у кожному випадку всі складові про стан здоров’я людини, як єдину персоналізовану систему. Ми запровадили систему “Всі спеціалісти для одного хворого.” Біохімічним дослідженням надавався індивідуальний характер і для груп хворих, і для кожного окремо, а оцінка біохімічних ознак проводилась у співставленні із молекулярними та цитогенетичними знахідками. За даними Ю.Б.Гречаніної [1, 2, 3] в наших попередніх публікаціях проведена оцінка частот і характеру змін органічних кислот у пацієнтів із МТХД. Ці данні набули особливого значення при поширені молекулярно-генетичних досліджень, бо вказували єдиний шлях до адекватної експертизи у кожного пацієнта. У пацієнтів з клінічними ознаками мітохондріальної дисфункції було досліджено 421 зразок сечі на органічні кислоти методом газової хроматографії/мас-спектрометрії. В результаті аналізу отриманих даних була виявлена група органічних кислот, підвищення або зниження яких найчастіше виявлялися у пацієнтів із МТХД. У 35 % зразків сечі пацієнтів було виявлено підвищення концентрації гліцерину, який є важливим компонентом тригліцеридів та фосфоліпідів, яке було розцінено як важлива біохімічна ознака не тільки функціональних, але і морфологічних змін мітохондрій. Моноаміноксидаза (МАО) - оксидоредуктаза, що дезамінує моноаміни виявлена у багатьох тканинах, але в найбільших концентраціях - в печінці, шлунку, нирках. У 23% зразків спостерігалося підвищення рівня метилмалонової кислоти. Метилмалонова кислота є дикарбоксиловою кислотою - С-метильованим похідним малонової кислоти. З’єднання метилмалонової кислоти з коензимом А - метилмалоніл-КоА, метаболізується в сукциніл КоА під впливом метилмалоніл-КоА-мутази. У цій реакції в якості кофактора потрібний вітамін В12, бо на цьому шляху метилмалонова кислота залучається до циклу Кребса. Метилмалоніл-КоА-мутаза каталізує ізомеризацію метилмалоніл-КоА в сукциніл-КоА і залучена у безліч життєво важливих метаболічних шляхів. Субстрат реакції - метилмалоніл-КоА утворюється з пропіоніл-КоА, який є продуктом катаболізму ізолейцину, валіну, треоніну, метіоніну, тиміну, холестеролу, метилмалонової кислоти і жирних кислот. Продукт реакції - сукциніл-КоА є ключовою молекулою в циклі Кребса. Метилмалонова кислота є критично важливою проміжною метаболітів жирів і білків. Аномалії в обміні цієї кислоти призводять до розвитку метилмалонової ацидурії, яка викликається блокуванням реакції перетворення метилмалоніл-КоА в сукциніл-КоА. Підвищення рівня метилмалонової кислоти спостерігається в групі енцефалопатичних форм синдрому деплеції мітохондріальної ДНК. Янтарна кислота була змінена в 19% зразків. Янтарна кислота є компонентом циклу Кребса. Її концентрація може підвищуватися внаслідок дефіциту рибофлавіну, коензиму Q10, надмірного перетворення глутаміну у янтарну кислоту мікроорганізмами ШКТ, а також природжених порушень обміну речовин. Янтарна кислота - це дикарбоксилова кислота. Її аніон сукцинат, який і входить в цикл Кребса, може віддавати електрони в дихальний ланцюг мітохондрій. Одним з найважливіших ферментів, що забезпечують метаболізм янтарної кислоти, є сукцинат дегідрогеназа. Мутації в чотирьох генах, що кодують субодиниці сукцинат дегідрогенази мітохондріального дихального ланцюга, асоційовані з широким спектром клінічних ознак. Сукцинат дегідрогеназа або сукцинат-коензим-(2-редуктаза (SQR) або Комплекс II є ферментом, розташованим на внутрішній стороні мітохондріальної мембрани клітин людини і багатьох бактеріальних клітин. Цей фермент бере участь у циклі Кребса, і в ланцюзі перенесення електронів. На 8 етапі циклу Кребса, SQR каталізує окислення бурштинової кислоти у фумарову, що супроводжується відновленням убіхінона до убіхінола. Процес відбувається в мембрані, шляхом одночасного протікання обох реакцій. Фермент складається з чотирьох субодиниць, зміни структури яких можуть призводити до наступних захворювань: - Sdh субодиниця А - синдром Лея, мітохондріальна енцефалопатія, атрофія зору. - Sdh субодиниця В - утворення пухлин в хромофинних клітинах, яке призводить до розвитку спадкової форми парагангліоми і спадкової феохромоцитоми. Частіше пухлини зустрічаються в злоякісній формі. Зміни структури ферменту в цій ділянці також можуть призводити до зменшення терміну життя і посилення вироблення супероксидних іонів. - Sdh субодиниця С - зменшення тривалості життя, посилення вироблення супероксидних іонів, розвитку спадкової форми парагангліоми і спадкової феохромоцитоми. Частіше пухлини зустрічаються в доброякісній формі. Ця мутація мало поширена. - Sdh субодиниця D - розвиток спадкової форми парагангліоми і спадковою феохромоцитом. Частіше пухлини зустрічаються в доброякісній формі і з’являються в області голови і шиї. Ця мутація також може призводити до зменшення строку життя і посилення вироблення супер оксидних іонів. У людини сукцинат дегідрогеназа не лише відіграє роль в генерації енергії в мітохондріях, а також в сприйнятті кисню і пригніченні розвитку пухлин [20]. Дефіцит фумарази клінічно проявляється багатоводдям і аномаліями мозку у плода. У періоді новонародженості проявляються сильні неврологічні розлади, відмова від їжі, відсутність розвитку і гіпотонія. На дефіцит фумарази у немовлят може вказувати наявність множинних важких неврологічних порушень на тлі відсутності метаболічного кризу. Причинами можуть бути зміни в активності як цитоплазматичної, так і мітохондріальної фумарази. Окреме підвищення фумарової кислоти при аналізі органічних кислот сечі є чинником, який може свідчити про дефіцит фумарази. У 19% випадках виявлено підвищення малонової кислоти. Це з’єднання є компонентом циклу Кребса. Основним ферментом, що забезпечує його метаболізм, являється малат-дегідрогеназа, яка каталізує перетворення малонової кислоти в оксалоацетат з використанням NAD, а також каталізує зворотню реакцію (ця реакція є оборотньою). Малат-дегідрогеназа також залучена в глюконеогенез - синтез глюкози з малих молекул. У мітохондріях піровиноградна кислота під дією піруваткар​боксилази перетворюється на оксалоацетат, який включається в цикл Кребса. Для виведення оксалоацетату з мітохондрії малатдегідрогеназа відновлює його до малата, який виходить з мітохондрії через її мембрану в цитозоль. Одразу після виходу в цитозоль малат окислюється назад в оксалоацетат цитозольної малатдегідрогеназою до оксалоацетату. На завершення фосфоенол-піруваткарбоксилаза перетворює оксалоацетат на фосфоенолпіруват. Керуючись виявленими співвідношеннями фено- та генотипів МТХД, були розроблені схеми лікування, виходячи із основних вимог лікування: лікування повинно бути доказовим; раціональним; ефективним; безпечним; з урахуванням спектру застосування препаратів; з урахуванням спектру дії препаратів; біологічних властивостей препарату і його компонентів; взаємодії компонентів; без спрощення розуміння патофізіологічних [11]. Доказовамедицина Клінічнідослідження Експерементальнідослідження Біохімічнідослідження фундаментальніособливостімолекул Нами розроблені підходи до лікування мітохондріальних дисфункцій та мітохондріальних захворювань на підставі існуючих у світі рекомендацій[21, 22, 25] та особисто досвіду. Методи лікування мітохондріальних захворювань Нозологічна форма / ензимний дефект Основні рекомендовані курси терапії Синдром Кернса-Сейра Хронічна прогресуюча зовнішня офтальмоплегія Дієта зі зниженим вмістом вуглеводів (до 10г / кг)   Коензим Q10 90 - 200 мг на добу Цитохром С 4,0 в / м або в / в N 10 L-карнітин 50 мг / кг Дімефосфон 30 мг / кг Вітамін С до 2 г на добу Вітамін Е до 300 - 500 мг на добу Мітохондріальна енцефаломіопатія, лактат-ацидоз, інсупьтоподібні епізоди (MELAS) Дієта зі зниженим вмістом вуглеводів (до 10г / кг) Коензим Q10 90 - 300 мг на добу. Янтарна кислота 10 мг / кг Цитохром С 4,0 в / м або в / в N 10 Нікотінамі до 500 мг на добу Рибофлавін 100 мг на добу L-карнітин 50 - 75 мг / кг Дімефосфон 30 мг / кг Вітамін С до 2 г на добу Вітамін Е до 300 - 500 мг на добу Підгостра некротизуюча енцефаломіопатія Лея / дефіцит піруваткарбоксилази Лактат-ацидоз/дефіцит піруваткарбоксилази Кетогена дієта з підвищеним вмістом жирів (до 75% калорійності раціону) Біотин 10 мг на добу Дімефосфон 30 мг / кг Фумарова ацидурія Дієта, збагачена вуглеводами; часте годування Цитохром С 4,0 в / м або в / в N 10 Коензим Q10 60 - 90 мг на добу а-Кетоглутарова ацидурія Тіамін 50 - 200 мг на добу Ліпоєва кислота 100 - 500 мг на добу Дімефосфон 30 мг / кг Синдром Барта Коензим Q10 90 - 200 мг на добу Цитохром С 4,0 в / м або в / в N 10 Янтарна кислота 10 мг / кг L-карнітин до 100 мг / кг Дімефосфон 30 мг / кг Вітамін С до 1 г на добу Вітамін Е до 300 мг на добу Глутарова ацидурія II типу Дієта зі зниженим вмістом жирів (15% калорійності раціону) і білків (<20%), підвищеним вмістом вуглеводів (65-70%) L-карнітин 100 мг / кг на добу Рибофлавін до 150 мг на добу Дефіцит ацил-КоА дегідрогенази жирних кислот з різною довжиною ланцюга Дієта зі зниженим вмістом жирів (15-20% калорійності раціону) і підвищеним вмістом вуглеводів (більше 60%), часте харчування L-карнітин до 100 мг / кг на добу Рибофлавін 25 - 50 мг на добу Висновок: 1. Мітохондріальні дисфункції представляють результати перебігу порушеного енергетичного обміну, в якому виникли зміни завдяки поєднаній дії ядерних або мітохондріальних мутацій, взаємодії генів, епігенетичних та зовнішньосередовищних факторів. 2. Мітохондріальні дисфункції можуть бути складовою частиною клінічних проявів у пацієнтів із різними спадковими захворюваннями. Уточнююча діагностика МТХД повинна включати клініко-генетичні, біохімічні та молекулярно-генетичні дослідження. 3. Глибоке вивчення характеру мутаційних процесів повинне з’єднуватися із додатковими дослідженнями, як морфо функціональними, так і біохімічними, що дозволяє гармонізувати отримані дані взаємодії генетичних подій і їхніх наслідків – біохімічних змін. 4. Персоналізований підхід до комплексної діагностики мітохондріальної дисфункції, проведення співставлення фено- та генотипу є единим шляхом подолання діагностичних проблем. Резюме: В статье представлен опыт популяционной и индивидуальной диагностики митохондриальных дисфункций (МТХД). Обследовано 1695 случаев МТХД у детей и 335 взрослых. Проанализированы клинические полиморфные признаки при различных нозологических формах митохондриальной дисфункции на примере трех сложных случаев митохондриальной болезни. Показана на основе анализа генов, ассоциированных с синдромом Лея, Альперса и MELAS генетическая гетерогенность заболевания. Отмечено перекрытие симптомов при различных вариантах МТХД. Подчеркнуто наличие одинаковые мутации при различных митохондриальных заболеваниях - феномен, который до сих пор не нашел объяснения. Высказано предположение, что привлечение различных вариантов генных мутаций к формированию фенотипа является отражением гено- моногенных природы заболевания. Тщательный клинико-генетический и молекулярно-генетический поиск вариантов при использовании современных тонких биохимических технологий - наиболее реальный путь поиска мишени поражения, который позволит применять патогенетическое лечение. Summary: The article presents the experience of population and individual diagnosis of mitochondrial dysfunction (MTCD). 1695cases of MTCH in children and 335 in adults have been studied. Clinical polymorphic signs have been analyzed for various nosological forms of mitochondrial dysfunction in the case of three complex cases of mitochondrial disease. Genetic heterogeneity has been shown on the basis of analysis genes which are associated with Leia, Alpers and MELAS syndromes. The overlapping of symptoms with different variants has been noted. Similar mutations have been found for various mitochondrial diseases - a phenomenon that has not been explained yet. It is suggested that inclusion of different types of gene mutations into fenotype formation is a reflection  of geno- and monogenic nature of the disease. Careful clinical genetic and molecular genetic search of variants using modern biochemical technologies is the most real way of search of affection target which will allow using pathogenetic treatment.   Список литературы: 1. Гречанина Ю.Б. Изучение влияния полиморфизмов мтДНК и полиморфных вариантов генов С677Т MTHFR, А66G MTRR на клинические проявления митохондриальных дисфункций. Автореферат. – 2012 – Харьков – 46с. 2. Гречаніна Ю.Б., Жаданов С.І., Гусар В.А., Васильєва О.В. Мітохондріальні хвороби: проблеми діагностики, лікування та профілактики. Навч.посібник.-Харків6 2008- 72с 3. Гречанина Ю.Б. Анализ изменений фенотипических признаков при диагностике митохондриальных заболеваний/ Ультразвукова перинатальна діагностика- 2010 №30- С.100-114 4. Гусар В.А., Гречаніна Ю.Б., Жаданов С.І.,Шурр Т., Гречаніна О.Я., Фадєєва А.Л. Визначення точкових мутацій в мітохондріальній ДНК з використанням методу ПЛР і рестракційного аналізу/ Клінічна генетика- 2011 №1-2- С. 95-111 5. Гречаніна Ю.Б., Гусар В.А. Характеристика фенотипу пацієнтів із мітохондріальною дисфункцією/ Клінічна генетика і перинатальна діагностика- 2013 №1- С. 87-88 6. Гречаніна Ю.Б., Гусар В.А., Гречаніна О.Я. Вивчення окремих популяційно-генетичних маркерів, притаманних населенню України / Клінічна генетика і перинатальна діагностика- 2013 №1- С. 87-88 7. Гречаніна Ю.Б., Молодан Л.В. Клініко-генетична характеристика хворих ізмітохондріальною дисфункцією/ Клінічна генетика і перинатальна діагностика- 2012 №2- С. 37-51 8. Y.B. Grechanina. The successful correction of the mitochondrial trifunctional protein (МТР) deficiency (OMIM # 609015) (mutation g.26477125 G GACT in exon 2 of gene HADNV chromosome 2) associated with the failure of cbl E (mutation MTRR GG) in a patient with the syndrome Johanson-Blizzard phenotype / Е.Y. Grechanina, H.P. Zdybskaya, I.A. Volobueva // Science and Education Studies - № 2. (16), July-December, 2015 -VOLUME III. -  С.785- 805 9. Гречаніна О. Я. Комплексний підхід до уточнюючої діагностики мітохондріальної дисфункції (МТХД) / О. Я. Гречаніна, Ю. Б. Гречаніна, А. Л. Фадєєва // Наука в епоху дисбалансів : збірник наукових праць Міжнародної конференції, Київ, 30 квітня 2014 р. – К., 2014. – Ч. 1 : Юридические науки, педагогические науки, медицинские науки. – С. 70-74 10. Митохондриальные болезни в Украине: роль мтДНК при сложных клинических синдромах и нейродегенеративных болезнях /Шурр Т.Дж., Гречанина Ю.Б., Гусар В.А., Гречанина Е.Я., Жаданов С.И. // Журнал Національної академії медичних наук України. - 2012. - Т. 18, № 1.- С. 55-67. 11. Торшин И.Ю., Громова О.А. Экспертный анализ данных в молекулярной фармакологии. –М.: МЦНМО, 2012. – 717с. 12. The epidemiology of pathogenic mitochondrial DNA mutations / P. F. Chinnery, M. A. Johnson, T. M. Wardell [et al.] // Ann. Neurol. – 2000. – Vol. 48, № 2. – P. 188–193. 13. Wallace D. C. The epigenome and the mitochondrion : bioenergetics and the environment / D. C. Wallace // Genes Dev. − 2010. – Vol. 24. – P. 1571−1573. 14. Bender A. Adaptive antioxidant methionine accumulation in respiratory chain complexes explains the use of a deviant genetic code in mitochondria / A. Bender, P. Hajieva, B. Moosmann // PNAS. – 2008. – Vol. 105, № 43. – P. 16496–16501. 15. Johannes A. Mayr. Lipoic Acid Synthetase Deficiency Causes Neonatal-Onset Epilepsy, Defective Mitochondrial Energy Metabolism, and Glycine Elevation/ Johannes A. Mayr, ∗ Franz A. Zimmermann, Christine Fauth, Christa Bergheim, David Meierhofer,4Doris Radmayr,Johannes Zschocke, Johannes Koch, and Wolfgang Sperl// Am J Hum Genet. 2011 Dec 9; 89(6): 792–797. 16. Изучение митохондриальных заболеваний в Украине : случай мутации ND5 de novo, значение патогенетических механизмов генных дефектов мтДНК ND5 / С. И. Жаданов, Е. Я. Гречанина, Ю. Б. Гречанина [и др.] // Журнал АМН України. – 2006. − Т. 2, № 3. – С. 443−456. 17. Fatal manifestation of a de novo ND5 mutation : implication for the pathogenetic mechanisms of ND5 gene defects / S. I. Zhadanov, E. Ya. Grechanina, Yu. B. Grechanina [et al.] // Mitochondrion. – 2007. – Vol. 7, № 4. – P. 260–266. 18. Suzuki, T., Suzuki, T., Wada, T., Saigo, K. & Watanabe, K. (2002) EMBO J. 21 , 6581–6589. pmid:12456664 Abstract HYPERLINK "http://www.pnas.org/lookup/google-scholar?link_type=googlescholar&gs_type=article&q_txt=Suzuki%2C+T.%2C+Suzuki%2C+T.%2C+Wada%2C+T.%2C+Saigo%2C+K.+%26+Watanabe%2C+K.+%282002%29+EMBO+J.+%0A+21%0A+%2C+%0A+6581%E2%80%936589.%0A+pmid%3A12456664%0A" \o "" Google Scholar 19. Yasukawa, T., Suzuki, T., Suzuki, T., Ueda, T., Ohta, S. & Watanabe, K. (2000) J. Biol. Chem. 275 , 4251–4257. pmid:10660592 Abstract/FREE Full Text HYPERLINK "http://www.pnas.org/lookup/google-scholar?link_type=googlescholar&gs_type=article&q_txt=Yasukawa%2C+T.%2C+Suzuki%2C+T.%2C+Suzuki%2C+T.%2C+Ueda%2C+T.%2C+Ohta%2C+S.+%26+Watanabe%2C+K.+%282000%29+J.+Biol.+Chem.+%0A+275%0A+%2C+%0A+4251%E2%80%934257.%0A+pmid%3A10660592%0A" \o "" Google Scholar 20. . Bernal A. J. Epigenomic disruption : the effects of early developmental exposures / A. J. Bernal, R. L. Jirtle // Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. – 2010. – Vol. 88, № 10. – P. 938−944. 21. Сухоруков В. С. К разработке рациональных основ энерготропной терапии / В. С. Сухоруков // Рациональная фармакотерапия. − 2007. – № 2. – С. 40−47. 22. Леонтьева И. В. Значение метаболических нарушений в генезе кардиомиопатий и возможности применения L-карнитина для терапевтической коррекции / И. В. Леонтьева, В. С. Сухоруков // Вестник педиатрической фармакологии и нутрициологии. − 2006. − № 2. – С. 52−61. 23. Гусар В.А. Мінливість та поліморфізм мітохондріальної ДНК української популяції // Журнал АМН України. – 2006. – Т.12, №4. – С.739-749. 24. Grechanina E.Y., Gusar V.A., Villems R. The mitochondrial DNA polymorphism in Ukrainian population // 5th Conference in forensic genetics and molecular anthropology. Croatia, 2007. – P.135. 25. Лукьянова Л. Д. Фармакология митохондриальных дисфункций : материалы симпозиума «Новые возможности коррекции митохондриальной дисфункции в лечении неврологических заболеваний» / Л. Д. Лукьянова // Consilium Medicum. – 2007. – Т. 9, № 8. – Режим доступа : http://consilium-medicum.com/magazines/cm/medicum/article/6495. 26. Kmiec B. Heteroplasmy as a common state of mitochondrial genetic information in plants and animals / B. Kmiec, M. Woloszynska, H. Janska // Curr. Genet. – 2006. – Vol. 50, № 3. – P. 149–159. PAGE 4 _1588688930.ppt Діагностичний каскад Підозрювані симптоми Синдроми Залучені органи Метаболіти Ергометрія, навантажувальні тести Дослідження залучених органів Біопсія Ергометрія Морфологія Молекулярна генетика мтДНК, нуклеарні гени