УДК 616.71-008.9:616.61-036.1]-092.9-07:612. ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ ПАТОЛОГИИ Проф. А.Н. Хвисюк, канд. биол. наук С.Б. Павлов, М.В. Кумечко, Н.М. Бабенко, канд. биол. наук А.В. Гончарова, Н.Г. Семко, Л.В.Черных Харьковская медицинская академия последипломного образования Одной из основных проблем современной нефрологии является изучение механизмов прогрессирования заболеваний почек с развитием в конечном итоге хронической почечной недостаточности. Большинство изменений, определяющих исход заболеваний почек, происходит в почечном интерстиции. Целью работы явилось изучение особенностей костного метаболизма в эксперименте на модели нарушения ремоделирования костной ткани при хронической болезни почек с помощью межклеточных медиаторов OPG и TGF-β1, а также оксипролина. Экспериментальное исследование проводилось в 2 группах белых крыс. Был изучен цитокиновый профиль в сыворотке крови лабораторных животных иммуноферментным методом и проведено биохимическое определение оксипролина в моче. Наши исследования показали увеличение сывороточного уровня OPG и уменьшение уровня TGF-β1 в сыворотке крови животных в группе с ХБП, в которой подтверждено снижение минеральной плотности костной ткани. Было показано увеличение уровней свободного и связанного оксипролина в моче животных экспериментальной группы. Обнаружена положительная статистически значимая корреляция между уровнем свободного и связанного оксипролина. Элевация уровней оксипролина, по-видимому, свидетельствует о нарушении динамического равновесия между деструкцией и биосинтезом коллагена, что может отражать как процесс развития фиброза почки, так и резорбцию костной ткани. Изученные изменения концентраций межклеточных медиаторов свидетельствуют об их важной роли как в развитии воспаления, приводящего к почечному фиброзу, так и в регуляции процессов костного ремоделирования. Ключевые слова: межклеточные медиаторы, оксипролин, ремоделирование костной ткани, хроническая болезнь почек ОСОБЛИВОСТІ МЕТАБОЛІЗМУ КІСТКОВОЇ ТКАНИНИ ПРИ МОДЕЛЮВАННІ ХРОНІЧНОЇ НИРКОВОЇ ПАТОЛОГІЇ Проф. О.М. Хвисюк, канд. біол. наук С.Б. Павлов, М.В. Кумечко, Н.М. Бабенко, канд. біол. наук А.В. Гончарова, Н.Г. Семко, Л.В. Черних Харківська медична академія післядипломної освіти Однією з основних проблем сучасної нефрології є вивчення механізмів прогресування захворювань нирок з розвитком хронічної ниркової недостатності. Більшість змін, що визначають результат захворювань нирок, відбувається в нирковому інтерстиції. Метою роботи було вивчення особливостей кісткового метаболізму в експерименті на моделі порушення ремоделювання кісткової тканини при хронічній хворобі нирок (ХХН) за допомогою міжклітинних медіаторів остеопротегерину (OPG), трансформуючого фактору росту-β1 (TGF-β1) та оксипроліну. Експериментальне дослідження проводилося в 2 групах білих щурів. Було вивчено цитокіновий профіль у сироватці крові лабораторних тварин імуноферментним методом та проведено біохімічне визначення оксипроліну в сечі. Наші дослідження показали збільшення сироваткового рівню OPG і зменшення рівню TGF-β1 в сироватці крові тварин в групі з ХХН, в якій підтверджено зниження мінеральної щільності кісткової тканини. Було показано збільшення рівнів вільного та зв'язаного оксипроліну в сечі тварин експериментальної групи. Виявлена позитивна статистично значуща кореляція між рівнем вільного та зв'язаного оксипроліну. Елевація рівнів оксипроліну, мабуть, свідчить про порушення динамічної рівноваги між деструкцією і біосинтезом колагену, що може відображати як процес розвитку фіброзу нирки, так і резорбцію кісткової тканини. Вивчені зміни концентрацій міжклітинних медіаторів свідчать про їх важливу роль як у розвитку запалення, що призводить до ниркового фіброзу, так і в регуляції процесів кісткового ремоделювання. Ключові слова: міжклітинні медіатори, оксипролін, ремоделювання кісткової тканини, хронічна хвороба нирок. FEATURES OF BONE METABOLISM AT MODELING IN CHRONIC KIDNEY DISEASE A.N. Khvisyuk, S.B. Pavlov, M.V. Kumechko, N.M. Babenko, A.V. Goncharova, N.G. Semko, L.V. Chernykh One of the problems of modern nephrology is development of a chronic renal failure owing to an illness of kidneys. Identification of mechanisms of this process is an actual task. Key pathological processes happen in interstition of kidney. The purpose of work was in revealing features of regulation of bone metabolism by a intercellular mediators - OPG and TGF-β1 in experiment. Researches were conducted on model of remodeling of a bone tissue in a chronic illness of kidneys. Research was conducted in two groups of white rats. Concentration of cytokines in serum of laboratory animals was studied by ELISA. In urine biochemical determination of the hydroxyproline was performed. Our studies showed an increase of OPG levels and a decrease of the level of TGF-β1 in the serum of the blood of animals in the group with CKD. In that group the decrease of mineral density of bone was confirmed. Increasing the levels of free and bound hydroxyproline in urine of animals of the experimental group was observed. A positive statistically significant correlation between the level of free and bound hydroxyproline was detected. Increasing levels of hydroxyproline apparently indicates disorders of the dynamic equilibrium between biosynthesis and degradation of a collagen. Revealed changes indicate important role of the concentration of intercellular mediators both in development of the inflammation leading to renal fibrosis and in processes of violation of bone remodeling. This fact reflected the interdependence of kidney fibrosis, and bone resorption. Key words: intercellular mediators, hydroxyproline, remodeling of bone tissue, chronic kidney disease. Одной из основных проблем современной нефрологии является изучение механизмов прогрессирования заболеваний почек с развитием в конечном итоге хронической почечной недостаточности. Снижение уровня клубочковой фильтрации коррелирует главным образом со степенью тубулоинтерстициальных, а не клубочковых повреждений, и большинство изменений, определяющих исход заболеваний почек, происходит именно в почечном интерстиции [6]. В очаге воспаления макрофаги являются ключевым источником цитокинов и факторов роста: интерлейкина-1b (ИЛ-1β), фактора некроза опухоли- α (TNF-α), фактора роста фибробластов (FGF), трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) и т.п. [9]. Под влиянием этих медиаторов происходит привлечение в интерстициальную ткань фибробластов. Фибробласты синтезируют компоненты внеклеточного матрикса, приводящие к чрезмерному накоплению коллагена и фиброзу [5]. Об активности процессов катаболизма коллагена судят по количественному содержанию специфичного для коллагена белка – оксипролина в моче [10]. TGF-β1 является одним из ключевых профибротических цитокинов, который играет важную роль в патогенезе фиброза почек путем активации каскада внутриклеточных сигнальных путей [8]. Остеопротегерин (OPG) – член семейства TNF-рецепторов, регулирующий костную массу за счет ингибирования дифференцировки и активации остеокластов. OPG является важным прогностическим фактором у пациентов с заболеваниями почек, т.к. в дополнение к регулированию обмена костной ткани, этот цитокин ингибирует кальциноз сосудов и модулирует воспаление в сосудистой стенке [2]. Цель работы: изучение особенностей костного метаболизма в эксперименте на модели нарушения ремоделирования костной ткани при хронической болезни почек с помощью оксипролина, а также межклеточных медиаторов OPG и TGF-β1. Материалы и методы. Экспериментальное исследование проводилось в 2 группах (по 50 животных) белых крыс самок в возрасте 9 мес. массой 210 ± 30 г. Первая группа – контрольная, была сформирована из интактных животных. Вторая группа состояла из крыс с нарушением ремоделирования костной ткани при хронической болезни почек (экспериментальная группа (ХБП)). Модель экспериментальной ХБП, развившейся с течением времени после однократного воздействия, которое вызвало острую почечную недостаточность, осуществляли путем однократного введения 50 % раствора глицерина в дозе 10 мл/кг массы тела животного. Нарушение ремоделирования костной ткани контролировали с помощью прямого измерения плотности кости, которую рассчитывали как отношение массы кости (г) к объему данной кости (см3). Объем кости определяли по объему вытесненной жидкости. Определение свободного (ОП своб.) и связанного оксипролина (ОП связ.) в моче проводили согласно методике П.Н. Шараева [1]. Исследование цитокинового профиля проводилось через 12 недель после инъекции глицерином методом иммуноферментного анализа в сыворотке крови. Уровень OPG определяли с помощью набора реагентов eBioscience (Австрія). Определение уровней TGF-β1 производилось с помощью набора BioVendor (Чехия). Математическая обработка результатов была проведена с помощью пакета статистического анализа Statistica 6.0. Различия между сравниваемыми показателями считали достоверными при p < 0,05. Результаты исследований. При исследовании плотности кости было отмечено ее достоверное снижение в группе животных с ХБП (1,431±0,038 г/см3) по сравнению с интактными животными контрольной группы (1,618±0,038 г/см3), что подтверждает нарушения ремоделирования костной ткани в этой группе. Наши исследования показали увеличение сывороточного уровня OPG в группе с ХБП, в которой подтверждено снижение минеральной плотности костной ткани (табл.). Таблица Уровни цитокинов в контрольной и экспериментальной группах Цитокины Группы Контроль Модель хронической болезни почек OPG, пг/мл 21,588±0,763 28,338±1,223* TGF-β1, нг/мл 26,331±0,62 22,863±0,557* ОП своб., мг/сут 0,061±0,007 0,101±0,015* ОП связ., мг/сут 0,141±0,016 0,174±0,029 * р<0,05 по сравнению с контрольной группой В настоящее время нет однозначной интерпретации причин повышения уровня OPG при ХБП. Часто элевация уровня OPG объясняется редукцией величины скорости клубочковой фильтрации [7]. Некоторыми исследователями была показана роль OPG в качестве ингибитора кальциноза сосудов у больных с ХБП, следовательно, высокие уровни этого цитокина могут быть истолкованы как попытки компенсировать продолжающийся процесс кальцификации [3]. В то же время, повышенное содержание OPG является фактором риска смертности от сердечно-сосудистых патологий при заболеваниях почек [11]. Таким образом, вопрос о том, представляет ли собой рост уровня OPG компенсаторный механизм для предотвращения дальнейшего повреждения артерий или является просто маркером начала сосудистого процесса кальцификации, остается невыясненным. Можно также предположить, что повышение уровня остеопротегерина, основная роль которого состоит в регулировании остеокластической резорбции, представляет собой гомеостатический ответ на воспаление при ХБП. В нашем исследовании уровень TGF-β1 в экспериментальной группе был достоверно ниже показателей животных из контрольной группы (табл.). Снижение уровня TGF-β1, являющегося одним из ключевых факторов прогрессирующего почечного фиброза, вероятно, связано с действием макрофагов, участвующих в процессе растворения осажденного внеклеточного матрикса ткани почки [4]. В группе животных с ХБП наряду с ростом уровня свободного оксипролина, отражающего распад коллагена, наблюдался рост содержания связанного оксипролина, который является индикатором биосинтеза коллагена. Этот факт свидетельствует о нарушении динамического равновесия между интенсивностью синтеза и степенью распада коллагена в сторону относительного превалирования процессов его деградации, что может отражать как процесс развития фиброза почки, так и резорбцию костной ткани. Наше предположение подтверждает обнаруженная нами положительная статистически значимая корреляция между уровнем свободного и связанного оксипролина (рис.1). Categ. Scatterplot: ОП-своб vs. ОП-связ Группы: К ОП-связ = 0.0741+1.0957*x Группы: ХБП ОП-связ = 0.0216+1.5166*x ОП-своб ОП-связ Группы: К -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Группы: ХБП -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 95% confidence Рис. 1. Корреляция между уровнями свободного и связанного оксипролина в группах животных. Было обнаружено, что OPG и TGF-β1 слабо и обратно коррелируют друг с другом в контрольной (r = -0,12) и в экспериментальной (r = -0,22) группах, что может свидетельствовать о том, что в регуляции синтеза этих цитокинов задействовано множество различных процессов, влияние которых не всегда отражают их сывороточные уровни. 1. Изученные изменения концентраций межклеточных медиаторов свидетельствуют об их важной роли как в развитии воспаления, приводящего к почечному фиброзу, так и в регуляции процессов костного ремоделирования. 2. Повышение содержания уровней свободного и связанного оксипролина, по-видимому, свидетельствует о нарушении динамического равновесия между деструкцией и биосинтезом коллагена, что может отражать как процесс развития фиброза почки, так и резорбцию костной ткани. Перспективным направлением дальнейших исследований может стать разработка методов адекватной патогенетической терапии как при заболеваниях почек, так и при других хронических патологиях. Литература 1. Определение свободного и связанного оксипролина в моче / П.Н. Шараев, Е.А. Ботникова, В.М. Иванова и др. // Лаб. дело. – 1990. – №12. – С.23–25. 2. Correlates of osteoprotegerin and association with aortic pulse wave velocity in patients with chronic kidney disease / JJ Scialla, MB Leonard, RR Townsend [et al.] // CJASN. – 2011. – Vol. 6(11). – P. 2612–2619. 3. Crystallizing nanoparticles derived from vascular smooth muscle cells contain the calcification inhibitor osteoprotegerin / M. Schoppet, M.M. Kavurma, L.C. Hofbauer, C.M. Shanahan // Biochem Biophys Res Commun. – 2011. – Vol. 407. – P. 103–107. 4. Ex vivo programmed macrophages ameliorate experimental chronic inflammatory renal disease / Y Wang, YP Wang, G Zheng [et al.] // Kidney Int. – 2007. – Vol. 72(3). – P. 290–299. 5. Farris A.B. Renal interstitial Fibroses: mechanisms and evaluation / A.B. Farris, R.B. Colvin // Curr. Opin. Naphrol. Hypertens. – 2012. – Vol. 21. – P. 289–300. 6. Imig J.D. Immune and Inflammatory Role in renal Diseas / J.D. Imig, M.J. Ryan // Compr. Physiol. – 2013. – Vol. 3(2). – P. 957–976. 7. Increased circulating levels of osteoclastogenesis inhibitory factor (osteoprotegerin) in patients with chronic renal failure / J.J. Kazama, T. Shigematsu, K. Yano [et al.] // Am J. Kidney Dis. – 2002. – Vol. 39(3). – P. 525–532. 8. Lan H.Y. Diverse roles of TGF-beta/Smads in renal fibrosis and inflammation / H.Y. Lan // Int. J. Biol. Sci. – 2011. – Vol. 7. – P. 1056–1067. 9. Lee S.B. Machanistic connection between inflammation and fibrosis / S.B. Lee, R. Kalluri // Kidney Int Supple. – 2010. – Vol. 119. – P. 22–26. 10. McAnulty R.J. Methods for measuring hydroxyproline and estimating in vivo rates of collagen synthesis and degradation / R.J. McAnulty // Methods Mol. Med. – 2005 – Vol. 117. – P. 189–207. 11. Plasma osteoprotegerin, arterial stiffness, and mortality in normoalbuminemic Japanese hemodialysis patients / A. Nakashima, J.J. Carrero, A.R. Qureshi [et al.] // Osteoporos Int. – 2011. – Vol. 22. – P. 1695–1701. _1525677279.bin