УДК 547.857.4:547.564.4:57.084:591.51
ЕМОЦІЙНО-ПОВЕДІНКОВІ РЕАКЦІЇ У ЩУРІВ: ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ КОФЕЇНУ, ПАРАЦЕТАМОЛУ ТА ЇХ ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ КОМБІНАЦІЇ В ТЕСТІ «ВІДКРИТЕ ПОЛЕ»

EMOTIONAL AND BEHAVIOURAL RESPONSES IN RATS: EXPERIMENTAL INVESTIGATION OF INFLUENCE OF CAFFEINE, PARACETAMOL AND THEIR PHARMACOLOGICAL COMPOSITION IN THE "OPEN FIELD" TEST
Федько К. О., Сирова Г. О., Лук’янова Л. В. / Fed’ko K. O., Syrovaya A. O., Lukyanova L.V.
Харківський національний медичний університет
Кафедра медичної та біоорганічної хімії
м. Харків, Україна
Ключові слова: кофеїн, парацетамол, фармакологічна композиція, «відкрите поле», формаліновий набряк.
Ключевые слова: кофеин, парацетамол, фармакологическая комбинация, «открытое поле», формалиновый отек.
Key words: caffeine, paracetamol, pharmacological combination, "open field", formalin edema.

Вступ. Нагальною проблемою на сучасному етапі розвитку медицини є створення комбінованих лікарських засобів, фармакологічні ефекти яких досягаються завдяки раціональній комбінації інгредієнтів. Комбінація в одному лікарському препараті кількох компонентів розширює його фармакологічний спектр [1]. Перевага комбінованих лікарських препаратів порівняно з монопрепаратами полягає у тому, що вони ефективніше ліквідують біль, запалення, ніж кожний окремий компонент [2, 3]. Такі комбінації дають можливість додавати до складу лікарських засобів активні речовини в менших дозах, що зменшує токсичність та негативні побічні ефекти [4].
За однією з найбільш визначних класифікацій усі анальгетичні лікарські засоби умовно поділяють на три основні групи, відповідно до рекомендованої терапевтичної практики (World Health Organization, 1986): 1 − центральнодіючі препарати (опіати), 2 – лікарські засоби периферичної дії, 3 – вторинні анальгетики. В медичній практиці в якості протибольових лікарських засобів широко застосовуються нітрогеновмісні органічні сполуки, серед яких відомий лікарський препарат парацетамол (належить до 2 групи). У парацетамола анальгезуюча дія обумовлена гальмуванням синтезу простагландинів. Кофеїн (1,3,7-триметилксантин) належить до медикаментів, що широко застосовуються у медичній практиці [5]. 
За літературними даними кофеїн підсилює протибольову дію ненаркотичних анальгетиків [6]. Механізм потенціювання протибольової дії пов’язують з покращенням біодоступності ненаркотичних анальгетиків при комбінації з кофеїном [7], індукцією кофеїном центральної холінергічної анальгезії [8], структурною схожості молекул аденозіну і кофеїну, що сприяє нейрохімічному механізму дії останнього у вигляді блокування специфічних Р1 „пуринових” рецепторів мозку [9-11].
Сполучення інгредієнтів у полікомпонентній комбінації взаємно підсилює їх фармакологічні ефекти [12, 13]. У клінічних дослідженнях підтверджено переваги комбінації перед монопрепаратами у фармакотерапії болю. 
Мета роботи. Вивчити вплив нітрогеновмістних органічних сполук (кофеїну, парацетамолу та їх фармакологічної композиції) на центральну нервову систему (ЦНС) за емоційно-поведінковими реакціями (ЕПР) у щурів у тесті «відкрите поле» в умовах формалінового набряку.
Матеріали і методи. Експериментальне дослідження проводили на 30 щурах лінії WAG середньою масою  210-230 г (5 груп по 6 тварин). Тварини 1-ї групи були контролем, їм однократно внутрішньошлунково (в/шл) вводили 3 % крохмальний слиз (2 мл на 200 г щура). Тваринам 2-ї групи моделювали формаліновий набряк шляхом субплантарного введення 2 % розчину формаліну у задню лапу щура та в/шл вводили 3 % крохмальний слиз. Тваринам 3-ї-5-ї груп  однократно в/шл у вигляді суспензії на 3 % крохмальному слизу вводили дослідні препарати та їх композицію: тваринам 3-ї групи вводили – кофеїн (0,6 мг/кг), 4-ї групи – парацетамол у дозі 30 мг/кг, 5-ї групи – комбінацію парацетамолу (30 мг/кг) з кофеїном      (0,6 мг/кг). Максимальний розвиток формалінового набряку спостерігається через 4 години після його моделювання, тому лікарські засоби, а також 3 % крохмальний слиз вводили за 1 годину до цього моменту. Оцінку впливу препаратів та їх комбінації на характеристики поведінки тварини проводили шляхом порівняння груп 3-5 з контролем (група 1) та з формаліновим набряком (група 2). Спостереження параметрів орієнтовно-дослідницької діяльності щурів у тесті «відкрите поле» [16, 17] і багатопараметрового методу оцінки тривожно-фобічних станів за загальноприйнятою методикою проводили протягом 3 хвилин [18]. 
Дослідження проводили відповідно до методичних рекомендацій Державного фармакологічного центру МОЗ України [15]. При виборі кількості тварин і розподілі їх за групами враховували економний підхід, біоетичні правила та вимоги статистики. Перерахунок з доз людини на щурів здійснено із використанням коефіцієнту видової чутливості за Риболовлевим Ю. Р. [20].
Статистичну обробку отриманих даних проводили загальноприйнятими методами [21, 22].
Роботу виконано на лабораторних тваринах з експериментально-біологічної клініки ХНМУ з урахуванням норм зберігання, догляду і годування, затверджених згідно принципів «Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей» [23] і ухвали Першого національного конгресу з біоетики [24]. Досліди проводилися в першій половині дня, що за даними літератури узгоджується з залежністю основних фармакологічних параметрів і фармакологічною активністю прийнятих до дослідження препаратів від циркадних ритмів [25, 26].
Результати та обговорення. Параметр орієнтовно-дослідницької діяльності щурів у тесті «відкрите поле» характеризується рядом величин: кількістю пересічених квадратів (горизонтальна рухова активність (ГРА)), вертикальних стійок (вертикальна рухова активність (ВРА)), обстежених отворів, умивань (груминг), уринацій та дефекацій за загальноприйнятою методикою [18, 19]. 
Вплив дослідних препаратів при моновведенні та їх композицій на ГРА та ВРА щурів. Аналіз орієнтовно-дослідницької поведінки щурів у тесті «відкрите поле» за показниками ГРА і ВРА розкриває мотиваційну складову характеристики тварин. При цьому вони намагаються ввійти в непрямий контакт із предметами, розташованими на відстані: щури принюхувалися до предметів, розташованих за межами «відкритого поля».
Моделювання формалінового набряку (група 2) сприяло статистично вірогідному збільшенню ГРА у 1,4 рази та мало тенденцію до збільшення ВРА у щурів відносно контрольної групи (табл. 1). 
При моновведенні кофеїну  (група 3) спостерігалося зменшення ГРА у 1,4 разу  та ВРА  у 1,2 разу відносно групи 2, і отримані дані статистично не відрізнялись від контрольних величин (група 1). Моновведення в умовах формалінового набряку парацетамолу (група 4) сприяло статистично вірогідному зменшенню ГРА і ВРА  у 1,5 разу відносно тварин групи 2, отримані дані статистично не відрізнялись від контрольної групи. 
При введенні композиції парацетамолу з кофеїном (група 5) спостерігалося: статистично вірогідне зменшення ГРА у щурів (у 1,3 разу) відносно групи 2, а також збільшення ВРА у щурів як відносно груп 1-5 (див. табл. 1).
Кількість обстежених отворів. Різновидом орієнтовно-дослідницької поведінки щурів є кількість обстежених отворів – показник ніркового рефлексу, який свідчить про здатність тварини досліджувати «відкрите поле», зокрема, заглядати в отвори. Кількість обстежених отворів характеризує пізнавальну активність щурів. 
Моделювання формалінового набряку, моновведення кофеїну (група 3), парацетамолу (група 4) та композиції парацетамолу з кофеїном (група 5)  не впливало на пізнавальну активність щурів (див. табл. 1). 
Таблиця 1
Показники поведінкової активності щурів в умовах формалінового набряку за методом «відкрите поле» (n=6)
№ з/п	Групи тварин	Кількість пересічень (ГРА)	Кількість стійок (ВРА)	Кількість заглядань у отвори	Кількість умивань (груминг)	Кількість уринацій	Кількість дефекацій	
1.		Контроль	40,33±1,74	5,67±0,17	1,67±0,21	6,67±1,38	0,67±0,26	4,17±0,40	
2.		Набряк формаліновий	57,17±1,25*	7,50±1,77	1,50±0,22	5,17±0,65	1,00±0,00	2,17±0,31*	
3.		Кофеїн	42,33±7,61**/*****	6,17±2,01	1,50±0,50	7,83±1,82	1,33±0,33	2,17±0,65*	
4.		Парацетамол	38,67±7,73**	5,00±1,73	1,17±0,17*	20,17±7,20*/**	1,50±0,22*/**	2,00±0,37*	
5.		Парацетамол+кофеїн	43,00±8,41**	8,83±3,46
	1,33±0,33	13,83±7,33	1,17±0,17
	2,67±0,76	
Примітки (середні ± помилка середньою): 
* - вірогідність результатів у відношенні до контрольної групи, р < 0,05; 
** - до щурів з формаліновим набряком, р < 0,05; 
*** - до щурів з моноведенням кофеїну, р < 0,05; 
**** - до щурів з моноведенням парацетамолу, р < 0,05; 
***** - до щурів з веденням фармакологічної композиції парацетамолу з кофеїном,  р < 0,05.

Косметична поведінка щурів. Груминг (косметична поведінка) щурів є важливою характеристикою поведінки тварин у «відкритому полі». Традиційно, щури більшу частину часу приділяють вичісуванню свого тіла, у порівнянні з переміщенням у просторі. Груминг тісно корелює з руховою активністю. Тому при дослідженні лікарських препаратів ця характеристика поведінки особливо цікава. 
При моделюванні формалінового набряку спостерігалося зменшення кількості умивань у    1,3 разу відносно контролю (група 1). При введенні на фоні формалінового набряку дослідних препаратів та їх композицій (групи 3-5) спостерігалося збільшення грумингу відносно групи 2 і контролю.  Введення парацетамолу (група 4) сприяло статистично вірогідному збільшенню грумингу як відносно групи 1 (у 3 рази), так і відносно групи 2 (у 3,9 разу). Введення фармакологічної комбінації парацетамолу з кофеїном (група 5) сприяло збільшенню грумингу як відносно групи 1 (у 2,07 разу), так і відносно групи 2 (2,7 разу) (див. табл. 1).  
Діурез, дефекація. Необхідно зауважити, що в якості показника емоційного статусу щурів значимість мають кількість уринацій і дефекацій. Рівень емоційного стану щурів оцінюється за кількістю уринацій і дефекацій.
Моделювання формалінового набряку (група 2) сприяло збільшенню діурезу у 1,5 разу відносно контрольної групи. 
При моновведенні кофеїну  (група 3) та його комбінації з парацетамолом (група 5) не спостерігалося статистично вірогідних змін уринацій у щурів відносно групи 2 (див. табл. 1).  
Моделювання формалінового набряку (група 2) сприяло статистичному вірогідному зменшенню дефекацій  у 1,9 разу відносно контрольної групи. 
Введення в умовах формалінового набряку кофеїну (група 3), парацетамолу (група 4) не впливало на кількість дефекацій відносно тварин групи 2.
При моновведенні парацетамолу (група 4) відбувалося статистично вірогідне зменшення кількості дефекацій у 1,1 разу відносно тварин групи 2. 
Введення в умовах формалінового набряку комбінації парацетамолу з кофеїном (група 5) сприяло збільшенню кількості дефекацій у щурів відносно групи 2 у 1,2 разу (див. табл. 1).
Висновки. Аналіз результатів впливу парацетамолу, кофеїну та їх композиції на ЕПР щурів в умовах формалінового набряку вказує на те, що доцільним є призначення кофеїну, парацетамолу та їх композиції (відносно ГРА), кофеїну (відносно грумингу), парацетамолу (відносно ВРА). 
Доцільно вивчити вплив нітрогеновмістних органічних сполук (кофеїну, парацетамолу та їх композиції) на ЕПР у щурів в умовах інших модельних патологій.

Резюме. Проведено исследования влияния кофеина, парацетамола и их композиции на эмоционально-поведенческие реакции крыс в условиях формалинового отека. Анализ результатов влияния парацетамола, кофеина и их композиции на эмоционально-поведенческие реакции крыс в условиях формалинового отека указывает на целесообразность назначения кофеина, парацетамола и их композиции (относительно горизонтальной двигательной активности), кофеина (относительно груминга), парацетамола (относительно вертикальной двигательной активности). 

Summary. Experimental research of  influence of caffeine, рaracetamol and their compositions on the emotional and behavioral responses in rats with formalin-induced edema was carried out. Analysis of results of  influence of caffeine, рaracetamol and their compositions on the emotional and behavioral responses in rats with formalin-induced edema suggests advisability of caffeine, paracetamol and their composition (relative to the horizontal motive activity), caffeine (relative to grooming), paracetamol (relative to the vertical motive activity).

Список літератури
1. Сирова Г. О. Патент України на корисну модель № 51082 «Спосіб потенціювання протибольової дії калієвої солі 2,4 – дихлорбензойної кислоти»,  МПК: А61К 31/00. 25.06.10. Бюл. № 12.
2. Оптимальный выбор нестероидного противовоспалительного препарата в современной клинической практике / Н. Н.  Козачок, М. Н. Селюк, С. А. Бычкова [и др.] // Новости медицины и фармации. – 2007. – № 8/218. – С.3–4.
3. Сирова Г.О., Бачинський Р.О., Петюніна В.М., Савельєва О.В., Бойко Є.П. Патент України на корисну модель № 56451. «Спосіб підсилення анальгетичної дії периферичного генезу нестероїдних протизапальних і протиревматичних засобів, похідних оцтової та пропіонової кислот». А61К31/519. 10.01.2011. Бюл. № 1. 
4. Дзяк Г. В. Нестероидные  противовоспалительные средства / Г. В. Дзяк, А. П. Вікторов, Е. И. Гришина – К.: Морион, 1999. – 122 с. 
5. Christopher J Derry Caffeine as an analgesic adjuvant for acute pain in adults / Christopher J Derry, Sheena Derry*, R Andrew Moore // Cochrane Pain, Palliative and Supportive Care Group. -  14 MAR 2012. - 4 JAN 2012. DOI: 10.1002/14651858.CD009281.pub2
6. Машковский М. Д. Лекарственные средства / М. Д. Машковский. – М.: ООО «Новая Волна», 2012. – С. 1216.
6.	Brune K. Safety of anti-inflammatory treatment: new ways of thinking / К. Brune // Rheumatology. – 2004. – 43 (Suppl.1). – P. 16-20.
7.	Morris M.B., Weinstein L. Caffeine and the fetus: is trouble brewing? // Amer. J. Obstet. and Gynecol. – 1981. – V.140,  № 6. – P.607-610.
8.	Квантово-фармакологічне обгрунтування потенціювальних протибольових властивостей кофеїну / Г. О. Сирова, Т. В. Звягінцева, І. С. Чекман, Т. Ю. Небесна // Фармац. журн. – 2008. – № 6. – С. 85-91.
9.	Кофеїн: Фізіологічні, біохімічні та квантово-фармакологічні властивості / І. Чекман,        Н. Горчакова, Т. Звягінцева, Г. Сирова, Н. Небесна // Вісник фармакології та фармації. – 2009. – № 6. – С. 2–7.
10.	Квантово-хімічне дослідження кофеїну /, І. С. Чекман,  Т. Ю. Небесна, Т. В. Звягінцева,  Г. О. Сирова // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии: материалы VI Междунар. научн.-технич. конф. – м. Севастопіль, 2010. – Т. 1. – С. 174-176.
11.	Сирова Г.О., Грабовецька Є.Р., Шаповал Л.Г., Наконечна С.А., Вакуленко Н.В., Бойко Є.П. Патент України на корисну модель № 59396  «Застосування композицій нестероїдних протизапальних засобів з кофеїном як препаратів з антиексудативною активністю», МПК: А61К31/00-31/80 10.05.2011. Бюл. № 1. 
12.	Сирова Г.О., Грабовецька Є.Р., Шаповал Л.Г., Бойко Є.П. Експериментальне вивчення антиексудативної дії композицій диклофенаку натрію та ібупрофену з кофеїном // Експериментальна і клінічна медицина.  – № 2 (51). – 2011. – С. 53–55.
13.	Исмайлова Х. Ю. Индивидуальные особенности поведения: (моноаминергические механизмы) / Исмайлова Х.Ю., Агаев Т.М., Семенова Т.П. – Баку: Нурлан, 2007. – 228 с.
14.	Доклінічні дослідження лікарських засобів : метод. рек. / за ред. О. В. Стефанова. – К., 2001. – 527 с.
15.	Hall C. S. Emotional behavior in the rat. I., Defecation and urination as measures of individual differences in emotionality // J. Comp. Psychol., 1934. – P. 385-403.
16.	The relationship between emotionality and ambulatory activity // J. Comp. Psychol., 1936. – P. 22, 345-452.
17.	 Родина В.И. Новый метод оценки тревожно-фобических состояний у крыс / В. И. Родина, Н. А. Крупина, Г. Н. Крыжановский, Н. Б. Окнина // Высшая нервная деятельность. – 1993. – № 43 (5). – С. 1006-1017.
18.	Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения /              Я. Буреш, О. Бурешова, Дж. П. Хьюстон. Под ред. проф. А.С. Батуева. – М., 1991. – 400 с.
19.	Рыболовлев Ю. Р., Рыболовлев Р. С. Дозирование веществ для млекопитающих по константам биологической активності / Ю. Р. Рыболовлев, Р. С. Рыболовлев // Доклады АН СССР. – 1979. –  № 6. – С. 1513–1516.
20.	Гланц С. Медико–биологическая статистика / С. Гланц; пер. с англ. – М.: Практика, 1998. – 459 с.
21.	Коросов А. В. Компьютерная обработка биологических данных: метод. пособие /            А. В. Коросов, В. В. Горбач. – Петрозаводск: изд-во ПетрГУ, 2010. – 84 с. 
22.	European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes // Council of European. – Strasbourg, 1986. – № 123. – 51 p.
23.	 Сучасні проблеми біоетики / відп. ред. Ю. І. Кундієв. – К. : «Академперіодика», 2009. – 278 с.
24.	 Дорогой А. П. К вопросу о хронопатологии, хронотерапии и хронофармакологии в кардиологии / А. П. Дорогой // Актуальные пробл. в соврем. терапии : сб. науч. тр. – Х., 1992. – С. 22–25.
25.	 Западнюк И. П. Лабораторные животные: разведение, содержание, использование в эксперименте / И. П. Западнюк, В. И. Западнюк, Е. А. Захария. – К.: Вища шк., 1983. –             С. 243–297, 342–376.