"Проблемы старения и долголетия", 2016,   Т. 25.         № l. –   С. 80–   86

УДК   577.121:604.6:633.34:(616.36+616.61]-091.8-092.9

Т. В. Горбач, Г. И. Губина-Вакулик,  С. А.  Денисенко

Харьковский национальный медицинский университет МЗ Украины, 61022 Харьков

ВЛИЯНИЕ ГЕННОМОДИФИЦИРОВАННОЙ СОИ В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ БЕЛЫХ КРЫС НА МЕТАБОЛИЗМ И ГИСТОЛОГИЮ ПЕЧЕНИ И ПОЧЕК У РОДИТЕЛЕЙ И ПОТОМКОВ

Изучено влияние длительного использования в рационе экс­ периментальных животных генномодифицированной сои на метаболические показатели и морфофункциональное со­ стояние печени и почек у крыс-матерей и их потомков. Ре­ зультаты исследования свидетельствуют о появлении по­ вреждений печени и почек с исходом в ускоренное старение этих органов и организма в целом.

Ключевые слова: генномодифицированная соя, крысы, печень, почки, метаболизм, гистология.

В настоящее время вопрос о безопасности генномодифицированных (ГМ) продуктов остается открытым и приобретает все больщую актуальность. В научной литературе имеются данные как о безопасности упот.Ребления продуктов, содержащих ГМО (генномодифицированные организмы), так и о возможных негативных последствиях. Так, в работах китайских иссле­ дователей показано, что кормление лабораторных мышей ГМ-свининой, богатой на омега-3 полиненасыщенные кислоты, не оказало существен­ ного влияния на биохимические показатели крови, распределение Т-кле­ ток, иммуноглобулинов и количества бактерий в кишечнике и фекалиях [5]. Аналогичный вывод бьш сделан при постановке эксперимента на трех поколениях крыс Sprague-Dawley, которые получюш корм, на 70 % со­ стоящий из рисовой муки, полученной из трансгенной линии риса, обо­ гащенной амилозой и резистентным крахмалом [6]. При этом, по словам авторов, наблюдались некоторые статистически значимые различия по сравнению с крысами, получавшими изогенную рисовую диету или обыч­ ную стандартную диету, но авторы посчитали эти различия случайными.
В других исследованиях показано, что при ддительном употреблении ГМ-кукурузы у крыс изменяется гормональный фон, в 2 раза чаще разви-

© Т. В. Горбач, Г. И. Губина-Вакулик , С. А. Денисенко, 2016.

80	ISSN 0869-1703. Пробл. старения и долголетия. 2016. Т. .2 5. № 1

ВЛИЯНИЕ ГЕННОМОДИФИЦИРОВАННОЙ СОИ В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ БЕЛЫХ КРЫС НА МЕТАБОЛИЗМ...    81
вается рак, тяжелые нефропатии [5]. Учитывая наблюдаемое расширение списка ГМО, аК1ИВное продвижение ГМ-продуктов на полки магазинов, необходимо продолжить экспериментальные исследования последствий использования ГМ-продуктов в рационе питания современного человека, исходя из гипотетической вероятности развития ускоренного старения.
Цель работы – оценить влияние генномодифицированной сои в рационе питания экспериментальных животных (родителей и потом­ ков) на метаболические процессы и гистологическую картину печени и почек, трактуя результаты с точки зрения геронтологии.
Материал и методы. Эксперимент проведен на половозрелых кры­ сах-самках в возрасте 3 мес, распределенных на 3 группы ·(по 6 особей в каждой) . 1 – интактные находились на стандартном рационе вивария (группа Инт.); 2 – группа Эксп. Соя, рацион которых содержал немодифицированную сою сорта "Рядова" в количестве, покрывающем 50 % потребности в белках; 3 – группа ГМ-соя, в рацион которых в аналогичном соотношении входила генномодифицированная соя (сорт "Roundup Ready" линии 40-3-2, которая содержала трансгены cp4epsps и регуляторные элементы –  промотер E35S и терминатор NOS).
Через 2 мес. после начала эксперимента к самкам подсадили сам­ цов, получили потомство. После перехода на самостоятельное питание крысята имели такой же рацион , как и их матери. То есть были сфор­ мированы такие же группы животных-потомков: гр. Инт. – 20 крысят, Эксп.Соя – 19 крысят, группа ГМ-соя –  25 крысят.
Крысы-самки употребляли специфический пищевой рацион в течение 6 мес. и были выведены из эксперимента путем декапитации под легким эфирным наркозом в возрасте 9 мес. Животных-потомков выводили из эксперимента путем декапитации в возрасте 3 мес., то есть у этих животных внутриутробное развитие и период материнского вскармливания протекали на фоне употребления крысой-матерью спе­ цифического рациона, затем в течение двух мес. для самостоятельного питания использовали тот же специфический рацион.
Постановка эксперимента проведена согласно требованиям, предъяв­ ляемым к экспериментам на животных (Страсбург, 1985, Украина, 2001).
Для биохимических исследований использовали сыворотку крови и гомогенат тканей. В сыворотке крови определяли активность сорбитол­ дегидрогеназы спектрофотометрическим методом [2] и активность трансамидиназы спектрофотометрически по цветной реакции Саккаrуй [1]. Разделение белков и определение молекулярной массы проводили методом электрофореза [3]. Содержание АТФ и гликогена в гомогена­ тах ткани определяли спектрофотометрическими методами [3]. Мито­ хондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования, активность НАД-изоцитратдегидрогеназы митохондрий определяли спектрофотометрическим методом [3]. Активность аминотрансфераз, щелочной фосфатазы (ЩФ), содержание общего белка, липидов в го­ могенатах печени и почек определяли с помощью наборов реагентов фирмы  "Филисит Диагностика"  (Днепропетровск,  Украина).  Альдо-

ISSN 0869-1703. Пробл. старения и долголетия. 2016. Т. .2 5. № 1

82                          Т. В. ГОРБАЧ, Г. И. ГУБИНА-ВАКУЛИК, С. А. ДЕНИСЕНКО
лазную активность определяли с помощью наборов реактивов  фирмы "Ольвекс" (РФ).
Для морфологического исследования печень и почки обрабатывали по обычной методике: фиксация в 10 % растворе формалина, спиртовая проводка, заливка в парафин и изготовление срезов. Использовали окраски срезов гематоксилином-эозином и галлоцианином по Эйнар­ сону (суммарные нуклеиновые кислоты). Полученные гистологические препараты изучали с помощью микроскопа "Axiostar-plus " (Zeiss, Герма­ ния) с последующей морфометрией на компьютерных изображениях микропрепаратов по программе "ВидеоТесТ" (С-Пб., РФ).
Статистический анализ проведен методом вариационной статис­ тики с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение. Изучение биохимических показателей в сравниваемых группах позволило выявить следующие закономерности. Так, использование в рационе питания экспериментальных животных немодифицированной сои не привело к изменению значений изучаемых показателей метаболизма в печени и почках (табл. 1, 2).

Группа

Биохимические показатели в rомоrенатах печени 9-месячных крыс-самок в условиях разных рационов питания, М ± т

Таблица 1

	Общий белок,
мг/г ткани	Общие липиды, мг/г ткани	Гликоген,
мг/г ткани	АсАТ,
ммоль/ (мин·г белка)	АлАТ,
ммоль/ (мин·г белка)		

ЩФ
ммоль/

(с·г белка)
Инт.	237,65 ± 19,08   65,66 ± 5,42	82,12 ± 4,41   12,24 ± 1,05	45,23 ± 2,13	1,38 ± 0,09

Эксп. Соя

215,23 ± 16,73   61,05 ± 3,47   86,49 ± 5,79   11,48 ± 1,06	43,72 ± 3,11	1,29 ± 0,07

ГМ-соя 187,39 ± 15,16* 78,39 ± 4,68*# 74,68 ± 5,45 15,59 ± 1,34*# 51.25 ± 2,64*# 2,43 ± 0,16*#
Примечания (здесь и в табл. 2-4): * - Р < 0,05 по сравнению с rрупой Инт., # - Р < 0,05 по сравнению с групой Эксп. Соя.

Биохимические показатели в rомоrенатах почек 9-месячных крыс-самок в условиях разных рационов питания, М ± т

Таблица 2

АсАТ,

АлАТ,

Группа

Общий белок,
мг/ г ткани

ммоль/

ммоль/

(мин·г белка) (мин·г белка)

Инт.

Изоцитрат- дегидрогеназа, мкмоль/
(мин-г белка)
153,28 ± 11,22  2,32 ± О,16	3,09 ± 0,27	34,68 ± 2,27

Альдолаза,
мк.моль/ (мин·г белка)
4,28 ± 0,41

АТФ,
мкмоль/ г ткани
1,43 ± 0,17

±

Эксп.	140,0 ± 10,25  2,09 ± 0,13	2,92	0,14	35,48 ± 2,66	3,97 ± 0,24	1,34 ± 0,22
Соя
ГМ-соя   132,11 ± 8,43* 3,04 ± 0,29*#  3,37 ± 0,21	30,25 ± 2,37	6,33 ± 0,42*# 0,82 ± 0,04*

У 9-месячных самок группы ГМ-соя в гомогенатах печени отме­ чается тенденция снижения содержания гликогена, достоверное сниже­ ние содержания общего белка, достоверное увеличение содержания об­ щих липидов, а также активности аминотрансфераз и ЩФ (см. табл. 1). Активация аминотрансфераз свидетельствует о повышенном катабо­ лизме белков, что вероятно, является причиной снижения содержания белка в гомогенатах печени.
ISSN 0869-1703. Пробл старения и долголетия. 2016. Т.25. № 1

ВЛИЯНИЕ ГЕННОМОДИФИЦОВАННОЙ СОИ В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ БЕЛЫХ КРЫС НА МЕТАБОЛИЗМ....	83

О нарушении морфофункционального состояния печени свидетель­ ствует также достоверное увеличение активности сорбитолдегидрогеназы в крови, которая является органоспецифическим ферментом печеночной ткани, попадающим в кровь при разрушении гепатоцитов: группа Инт. –  (1,34 ± 0,07) нмоль/(с·л), группа Эксп. Соя – (1,49 + 0,11) нмоль/(с·л), (Р> 0,05); группа ГМ-соя – (3,28 ± 0,16) нмоль/(с·л) (Р < 0,05).
Изучение фракционного состава белков сыворотки крови путем разделения белков по молекулярным массам в SDS-ПААГЕ в системе Лемли показало достоверное (в 20 раз) увеличение содержания низко­ молекулярных белков (с молекулярной массой 15709 Да и 11064 Да) у 9-месячных животных группы ГМ-соя, что также подтверждает  высо­ кий уровень катаболизма белков.
При  исследовании  почечной  ткани  выявлено,  что в митохондриях клеток у  9-месячных  самок группа  ГМ-соя установлено  снижение  ак­ тивности  изоцитратдегидрогеназы	при  увеличении  активности  алъдо­ лазы (см. табл.  2), что может свидетельствовать  о снижении  аэробных процессов  окисления  и увеличении  роли  гликолиза  в энергообеспече ­ нии  ткани.  Такие  изменения  могут  быть  связаны  с дисфункцией  ми­ тохондрий.  Концентрация  АТФ  в  гомогенатах  ткани  почек  снижена, что, по-видимому, связано с нарушением синтеза АТФ в митохондриях .  В гомогенатах почек также повышена активность АсАТ (достоверно) и АлАТ (недостоверно), снижено содержание белка, что свидетельствует о повышенном катаболизме белков. Подтверждением	активации  деструк­ тивных  процессов  в  почечной  ткани  является	увеличение	активности трансамидиназы  в сыворотке  крови;  поскольку этот  фермент  является органоспецифичным  для  почечной  ткани,  появление  его  в крови  сви­ детельствует о разрушении нефроцитов. Активность трансамидиназы в сы­
воротке крови в группе Инт. – 0 в Эксп. Соя – (1,64 +  0,12) ммоль/(с·л), в группе ГМ-соя – (18,64 ± 1,22) ммоль/(с·л).
Данные биохимических исследований о процессах разрушения в паренхиме почек и печени при наличии в рационе животных ГМ сои подтверждены морфологически.
У крыс-матерей группы ГМ-соя, в отличие от Эксп. Соя и группы Инт. в печени обнаружено формирование объемного макрофагально­ лимфоцитарного инфильтрата вокруг триад и склероза этих участков. В средней части трабекул появляются небольшие очаги цитолиза, вклю­ чающие в себя 1-2-3 гепатоцита; однако миграция лейкоцитов к таким очажкам отсутствует, поэтому мы полагаем, что их появление – это результат форсированного апоmоза. Цитоплазма гепатоцитов вакуоли­ зирована, содержание РНК снижено, т. к. оmическая плотность цито­ плазмы при окраске галлоцианинхромовыми квасцами по Эйнарсону до­ стоверно меньше, чем в группе Инт. То есть гистологическая картина печени соответствует хроническому персистирующему гепатиту.
В почках животных группы ГМ-соя, в отличие от крыс других групп, резко увеличено количество редуцированных  и склерозирован­ ных клубочков,  а остальные клубочки компенсаторно гипертрофирова ­ ны   с   макрофагально- лимфоцитарной    инфильтрацией   расширенного

ISSN 0869-1703. Пробл. старения и долголетия. 2016. Т. .2 5. № 1

84                                                             Т. В. ГОРБАЧ, Г. И. ГУБИНА-ВАКУЛИК, С. А. ДЕНИСЕНКО

мезангиума.	юкстагломерулярный	аппарат	почек	гиперплазирован, эпителий канальцев дистрофизирован,  частично дескамирован,  в цито­ плазме нефроцитов уменьшено содержание РНК, т. к. оптическая плот­ ность  цитоплазмы	нефроцитов  при  окраске  галлоцианинхромовыми квасцами по Эйнарсону достоверно меньше, чем в группе Инт. Строма почек  существенно  склерозирована  с небольшой  макрофагально-лим­ фоцитарной  инфильтрацией.  То есть и в почках наблюдается  гистоло­ гическая картина ускоренного разрушения паренхимы и развития скле­ роза, соответствующая хроническому мезангиально-пролиферативному гломерулонефриту и тубуло- интерстициального нефриту.
Биохимические изменения, выявленные в тканях печени, почек и в сыворотке крови у крыс-самок, употреблявших ГМ-сою в течение 6 ме­ сяцев, обнаруживаются и у потомков. Причем у потомков эти изме­ нения развились уже в возрасте 3 месяцев (табл. 3, 4), то есть гораздо раньше, чем у крыс-матерей.
Таблица 3
Биохимические  показатели  в гомоrенатах  печени 3-месячных крыс-потомков  в условиях разных рационов питания, М ± т

Группа

Белок,
мг/г ткани

Лиrшды,
мг/г ткани

АсАТ,
ммоль/ (мин·г белка)

АлАТ,
ммоль/ (мин·г белка)

ЩФ,
ммоль/
(с-г белха)

Инт.	211,44 ± 18,31  72,43 ± 5,17
Эксп. Соя  198,33 ± 16,05	68,34 ± 6,0
Группа

15,48 ± 1,22
17,06 ± 1,43

53,18 ± 3,14
55,24 ± 4,08

1,79 ± О,16
1,66 ± о,14

ГМ-соя

170,22 ± 15,0* 84,11 ± 6,07*11    22,16 ± 1,72*11

68,45 ± 4,22*11

1,83 ± 0,17

Таблица 4
Биохимические  показатели  в гомогенатах почек 3-месячных крыс-потомков  в условиях разных рационов питания, М ± т
Белок,	АсАТ,	АлАТ,	АТФ,

мг/г ткани	мкмоль/г ткани

Группа	ммоль/	ммоль/
(мин·г белка)	(мин·г белка)

Инт.
Эксп. Соя Группа ГМ-соя

145,23 ± 10,21
139,55 ±  12,11
120,06 ± 14,38

2,75 ± 0,22
3,02 ± 0,29
2,51 ± 0,14

6,41 ± 0,47
5,97 ± 0,52
8,0 ± 0,44*/t

l ,32 ± 0, l l
l,24 ± О, 12
О,79 ± 0,05*tt

В гомогенатах печени у них обнаружено снижение содержания белка, повышение содержания липидов, повышение активности АлАТ и АсАТ. В гомогенатах почек жи.вотных-потомков также выявлено сниженное содер­ жание белка, повышение активности АлАТ, уменьшение содержания АТФ. При морфологическом исследовании печени и почек потомков оказалось, что в Эксп. Соя гистологическая картина не отличается от группы Инт.
В группе ГМ-соя трабекулярность печеночной ткани сохранена. За­ метное количество гепатоцитов имеют темные, гиперхромные ядра – ка­ риопикнотические. Отмечается большое коJШЧество двуядерных и поли­ плоидных гепатоцитов, что имеет компенсаторное значение. Обнаружены многочисленные локусы цитолизиса, что привело к формированию внут­ ридольковых маленьких очагов воспаления. В эндотелиальной выстилке

ISSN  0869-1703. Пробл. старения и долголетия. 2016. Т.25. №  1

ВЛИЯНИЕ ГЕННОМОДИФИЦОВАННОЙ СОИ В РАЦИОНЕ ПИТАНИЯ БЕЛЫХ КРЫС НА МЕТАБОЛИЗМ....                         85

синусоид отмечается увеличение количества эндотелеоцитов и клеток Купфера. Склероз имеет не только перипорта.льный характер, но и фор­ мируется и вокруг центральных вен долек, а также во II зоне ацинусов. В целом морфологическая картина печени крыс-потомков группы ГМ-соя может быть оценена как хронический активный гепатит.
В почках у животных-потомков группы ГМ-соя обнаружены приз­ наки внутриутробной гиперплазии клубочков и приобретенного хрони­ ческого мезангиального гломерулонефрита во всех функционирующих клубочках. Существенная часть клубочков редуцирована, склерозиро­ вана, а юкстагломерулярный аппарат в клубочках на rранице с моз­ говым веществом гиперплазирован, как и у крыс-матерей. Каналъце­ вый эпителий значительно поврежден. Строма склерозирована и ин­ фильтрирована макрофагами, лимфоцитами, много активных фибро­ бластов, что позволяет диагностировать и интерстициальный нефрит.
Таким образом, проведенные нами исследования свидетельствуют о значительном влиянии ГМ сои на метаболические показатели у крыс (родителей и потомков) при длительном кормлении этим продуктом. Повышение катаболизма белков в тканях печени и почек, сопровож­ дающееся низкоэнергетическими сдвигами в адениловой системе, сви­ детельствует об ускоренном старении организма.
Полностью совпадает с этим выводом результат морфологического исследования печени и почек. В обоих органах наблюдается повреж­ дение паренхимы, хронический воспалительный процесс и склероз, что также можно расценить как путь ускоренного старения.
Возможно, обнаруженные нами изменения в морфофункциональном состоянии печени и почек связаны с длительным поступлением в ор­ ганизм гербицида раундапа, в небольших количествах содержащегося в сое. Фирмы-экспортеры ГМ сои уrверждают, что в продукте отсутствуют гербициды. При очень небольшом содержании гербицида в сое при кратковременном кормлении у животных не выявляются метаболические нарушения. Однако длительное применение продукта привело к кумуля­ тивному эффекту и проявлению метаболических нарушений .
Можно предположить и другой механизм патогенеза повреждения почек и печени –наличие в ГМ сое, в отличие от немодифицированной сои, новых белков, плохо подвергающихся гидролизу в ЖКТ. В этом слу­ чае активируются процессы гниения в кишечнике, что приводит к увели- чению концентрации токсинов эндогенного происхождения. О наличии хронической интоксикации свидетельствует активация катаболизма бе.лков и повышение содержания средне- и низкомолекулярных белков в сыво­ ротке крови.
Список использованной литературы
1.	Визначення активностi трансамiдiназ в сироватцi кровi унiфiкованим мето­ дом // Клiнiчна бiохiмiя / за ред. проф. О. П. Тимошенко. - К.: Про­ фесiонал, 2005. - С. 26 l-263.
2.	Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. проф. В. В. Мень­ шикова. - М.: Медицина , 1987. - 368 с.

ISSN 0869-1703. Пробл. старения и долголетия. 2016. Т.25.  № 1

86                                                             Т. В. ГОРБАЧ, Г. И. ГУБИНА-ВАКУЛИК, С. А. ДЕНИСЕНКО

3.	Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / Под ред. М. И. Прохоровой.- Л.: изд-во Ленинrр. ун-та, 1982.- 256 с.
4.	Seralini G. Е., Claire Е., Mesnag R. et al. Long term toxicity of а Roundup herblcide and а Roundup-tolerant genetically modified maize // Food Chem Toxicol. - 2012. - 50, Issue 11. Р. 4221-4231.
5.	Tang М., Qian L., Лапg S. et al. Functional and safety evaluatjon of transgenic pork rich in omega-3 fatty acids // Transgenic Res. - 2014. - 23, No 4. - Р. 557-571.
6.	Zhou Х Н , Dong У., Zhao У S. et al. А three generation reproduction study with Sprague-Dawley rats consuming  high-amylose transgenic rice // Food Chem Toxicol. - 2014. - 74. - Р. 20-27.
Поступила  15.02.2016

ВПЛИВ ГЕННОМОДИФIКОВАНОЇ COЇ У PAЦIOHI ХАРЧУВАННЯ БIЛИХ ЩУРIВ НА МЕТАБОЛIЗМ ТА ГIСТОЛОГІЮ ПЕЧIНКИ І НИРОК У БАТЬКIВ І НАЩАДКIВ
Т. В. Горбач, Г. І..  Губiна-Вакулiк, С. А. Денисенко
Харкiвський нацiональний медичний унiверситет МОЗ України, 61022 Харкiв

Вивчено вплив тривалоrо використання в рацiонi експери­ ментальних тварин генномодифiкованоi сої на метаболiчнi показники та морфофункцiональний стан печiнки i нирок у щурiв-матерiв та їх нащадкiв. Результати дослiдження свiд­ чать про появу пошкоджень печiнки і нирок з виходом в прискорене старiння цих орrанiв i орrанiзму в цiлому.

INFLUENCE  OF GENETICALLY  MODIFIED  SOY
IN EXPERIMENTAL  ANIМALS  DIET ON ТНЕ METAВOLISM AND HISTOLOGY OF LIVER AND КIDNEYS
Т. V. Gorbach, G. 1. Gyblna-Vakulyck, S. А. Denisenko Kharkov National Medical U niversity Ministry of Health Ukraine,
61022 Kharkov

Effects of the long-term use of the genetically modified soybeans in the experimental rats (mothers and their descendants) on the metabolic parameters and morpho-functional state of the liver and kidneys have been studied. The findings revealed the appearance of damages in the liver and kidneys followed bу an acce1erated aging of these organs and organism as а whole.