УДК 616.314.17-008.1:579.84:616.33/345

Видовой состав анаэробной микрофлоры пародонтальных карманов у больных генерализованными формами пародонтита на фоне патологии органов желудочно-кишечного тракта

И. И. Соколова, Е.Н. Рябоконь, В.В.Олейничук

Харьковский Национальный медицинский университет

Факт существования тесной связи между заболеваниями пародонта и патологией органов желудочно-кишечного тракта общеизвестен [1,2]. Высокая распространенность и особенности клинического течения болезней органов пищеварения, делают их значимой медико-социальной проблемой современного общества [3]. Инфекционная теория генеза патологии гастро-дуоденальной системы, после открытия австралийскими учеными B.Marshal и R.Warren бактерии Helicobacterpylori (H. pylori), является приоритетной в гастроэнтерологии [4]. В современной литературе появились публикации, авторы которых доказывают способность H. pylori индуцировать не только болезни органов пищеварения, но и внегастральную патологию[5-8]. Данная проблема является актуальной для многих медицинских специальностей, и для стоматологии в частности, поскольку бактерия в высоких концентрациях вывляется в зубном налете и пародонтальных карманах [9]. Многие исследователи считают микробный фактор пусковым механизмом в развитии заболеваний пародонта, определяющим характер течения воспалительных реакций в пародонте
В 1994-1995 гг. ВОЗ рекомендовала среди нормальной или резидентной флоры полости рта выделять так называемые «периодонтопатогенные виды», относящиеся к группе анаэробов, которые обладают высокими адгезивными, инвазивными и токсическими свойствами по отношению к тканям периодонта. Книмотносятбактерии Actinobacillus (Aggregatibacter) actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus (Tannerella forsythia) и Treponema denticola. Отличительной особенностью этих бактерий является то, что при их разрушении выделяются чрезвычайно активные эндотоксины, которые приводят к длительному воспалению и разрушению тканей десны и альвеолярного отростка челюсти [10]. Они также вызывают общую интоксикацию организма, с поражением иммунной и эндокринной систем, провоцируют развитие атеросклероза сосудов мозга и сердца, повышают риск развития инсульта и инфаркта миокарда [11].В виду того, что тесные анатомические, нервные и гуморальные взаимосвязи между желудочно-кишечным трактом и полостью рта создают предпосылки для вовлечения пародонта в воспалительный процесс при патологии органов пищеварения, возникает вопрос: как отражается контаминация H. pyloriна видовом составе микрофлоры пародонтальных карманов у больных с генерализованным пародонтитом, протекающим в сочетании сH. pylori-ассоциированной патологией органов желудочно-кишечного тракта?
Следует указать, что основная трудность изучения, как анаэробных бактерий, так и H. pylori связана с техническими проблемами культивирования данных микроорганизмов. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР), как современный метод молекулярной биологии, позволяет решить эту проблему. Обладая высокой специфичностью, ПЦР дает возможность идентифицировать видоспецифичный фрагмент бактериальной ДНК, и таким образом, типировать и дифференцировать штаммы бактерий. Материалом для проведения диагностики могут служить биоптаты слизистой оболочки, смывы из полости рта, зубной налет, содержимое пародонтальных карманов [12].
В связи с вышеизложенным, целью нашей работы явилось сравнительное изучение видового состава анаэробной микрофлоры пародонтальных карманов у больных генерализованным пародонтитом (ГП)в сочетании с H. pylori–ассоциированной патологией органов желудочно-кишечного тракта методоммультипраймерной ПЦР.
Материал и методы.Для решения поставленной задачи было сформировано 2 группы обследуемых по 20 человек в каждой. 1-ю группу составили лица сГП Ι - II степени тяжести, хронического течения,обусловленного местными неблагоприятными факторами (аномалии прикуса, нерациональное протезирование, плохая гигиена полости рта), без гастродуоденальной патологии, проходившими лечение на клинической базе кафедры терапевтической стоматологии в учебном стоматологическом центре ХНМУ. Во 2-ю группу вошли лица, имеющие аналогичный пародонтальный статус, но проходившие стационарное лечение в гастроэнтерологическом отделении областной клинической больницы г. Харькова с установленным диагнозом язвенная болезнь желудка или язвенная болезнь 12перстной кишки.Пациенты данной группы имели положительный результат ПЦР на инфицированность H. рylori биоптатов, полученных при фиброгастродуоденоскопии.
Детекция патогенов в полости рта осуществлялась методом мультипраймерной ПЦР. Материал исследования - зубной налет и содержимое пародонтальных карманов. Забор материала осуществляли стерильными бумажными абсорбирующими штифтами (Meta Dental – Корея) №35. Выделение ДНК проводилось щелочным методом с помощью наборов «ДНК-экспресс» (НПФ «ЛИТЕХ», Москва). В качестве ДНК-мишени использовались нуклеотидные последовательности генов (16S rRNK)H. Рylori,(Cdt) B Actinobacillus actinomycetemcomitans,(RgpA) Porphyromonas gingivalis, (Fim A)Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus, Treponema denticola. Амплификацию осуществляли под контролем компьютерной программы МС16 на мультициклере «Терцик» МС-2 (АО «ДНК-Технологии», Москва). Температурный режим реакции: предварительная денатурация ДНК при температуре 94°С в течение 5 мин; 35 циклов, включающих в себя денатурацию ДНК при температуре 95°С в течение 1 мин., отжиг праймеров при температуре 61°С в течение 1 мин., синтез коплементарной цепи при температуре 72° С в течение 2 мин. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляли раствор бромистого этидия, образущий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием ультрафиолетового облучения способны флуоресцировать, что регистрировали в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в 1,5% агарозном геле в трис-боратной буферной системе.
Молекулярно-генетические методы обследования проведены на базе Научно-производственной фирмы “АНАЛИТИКА”, г.Харьков, (лицензия МОЗ Украины №202798).
Результаты и обсуждение. Полученные нами результаты исследования отражены в таблице 1.
Таблица 1.
Микрофлора пародонтальных карманов больных ГП по данным ПЦР

Виды микроорганизмов	1-я группа (n=20)	2-я группа(n =20)	
	n	%	n	%	
Helicobacter pylori	3	15	20	100	
Bacteroides forsithus	7	35	11	55	
Fusobacterium nucleatum	3	15	5	25	
Prevotella intermedia	8	40	10	50	
Porphyromonas gingivalis	8	40	12	60	
Actinobacillus actinomycetemcomitans	4	20	7	35	
Treponema denticola.	9	45	14	70	

В результате проведенных нами исследований методом мультипраймерной ПЦР зубного налета и содержимого пародонтальных карманов было установлено, чтоH. pylori встречался у всех пациентов 2-й группы (100%) и у 3 пациентов 1 –й группы (15%). Bacteroides forsythus у 7пациентов 1-й группы (35%) и у 11 пациентов 2-й группы (55%). Выявлено 3 положительных результата детекции Fusobacterium nucleatum у больных 1-й группы (15%) и у 5 больных 2-й группы (25%); Prevotella intermedia 8 в 1-й группе (40%) и 10 во 2-й группе (50%). Porphyromonas gingivalis определялась у 8 человек 1-й группы (40%) и у 12 человек 2-й группы (60%).
Actinobacillus actinomycetemcomitans был обнаружен у 4 пациентов 1-й группы (20%) и у 7 пациентов 2-й группы (35%). Положительный результат детекции Treponema denticola в 1-й группе был получен у 9 человек (45%) и у 14 человек 2- й группы (70%). Нами не было обнаружено корреляции между наличием в пробе какого-либо микроорганизма и степенью тяжести ГП, однако полученные данные позволяют выявить некоторые закономерности. Так, Actinobacillus actinomycetemcomitans иFusobacterium nucleatum встречались реже других анаэробов, как в 1-й, так и во 2-й группе.ДолятакихмикроорганизмовкакTreponemadenticola, Porphyromonasgingivalis, Prevotellaintermedia была диагностически значимым показателем. Тем не менее, встречаемость представителей анаэробной микрофлоры была выше у больных 2-й группы.
Данный факт можно трактовать следующим образом. Хотя физико-химические условия полости рта значительно отличаются от таковых в желудке, приспособляемость H. pylori к условиям существования остается высокой, что подтверждается положительными результатами ПЦР, полученными нами у больных 2-й группы. Если учитывать, орально - оральный путь инфицирования H. рylori; рассматривать H. рylori как симбионт, приспособленный к жизнедеятельности в неблагоприятных условиях желудка, среди которых наиболее агрессивные штаммы становятся патогенными; а также учитывать то, что бактерия обладает мощной уреазной активностью, закономерным будет предположить, что колонизация пародонтальных карманов H. рylori не может не отразиться на видовых ассоциативных взаимоотношениях микрофлоры пародонтальных карманов.С другой стороны, возникающие вследствие язвенной болезни дисфункции различных регуляторных систем, влекут за собой снижение барьерных свойств эпителия, благодаря чему возникают благоприятные условия для проявления патогенности условно-патогенной микрофлоры полости рта.
Выводы.
Проведенное нами исследование, позволяет заключить, что инфекция H. pylori в значительной мере отягощает течение ГП. Контаминация H. Pylori пародонтальных карманов может использоваться в качестве диагностического маркера смещения качественного состава микробиоценоза последних в сторону увеличения анаэробной микрофлоры.
Учет указанных особенностей позволит более точно и своевременно прогнозировать,диагностировать и проводить адекватное лечение заболеваний пародонта у больных с гастродуоденальной патологией ассоциированной с инфекцией H. pylori

Список литературы

1.Н.С. Робакидзе, А.В. Цимбалистов, М.А. Дубова. Развитие гастродуоденальной патологии у больных, инфицированных Helicobacter pylori, в стоматологическом аспекте // Вестн. С.-Петерб. ун-та. - Сер. 11. - 2006. - Вып. 1. - С. 110-116.
2. В.М. Лосев. Воспалительные заболевания пародонта у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки: особенности лечения // Материалы VI Съезда Научного общества гастроэнтерологов России. – Москва, 2006. – С.259 
3. М.В. Голубчиков. Cтатистичний огляд захворюваності населення України на хвороби органів травлення.//Сучасна гастроентерологія і гепатологія , №1, 2000, с.17-20.
4. А.С.Свинцицкий, Г.А. Соловьева. Патогенез язвенной болезни в свете современных представлений // Сучасна гастроентерологія.-2000.-№1.-С.27-28.
5. Г.Д. Фадеенко. Helicobacter pylori и внегастральные проявления // Український терапевтичний журнал.- 2004.№2 ,95-99с. 
6. А.А. Исмоилов, Д.Т. Махмудов. К вопросу о патогенетической взаимосвязи заболеваний пародонта с состоянием других органов и систем (обзор литературы) // Стоматология Таджикистана. – Душанбе, 2008. -№ 1. –С. 48-51.
7. Н.С. Робакидзе, А.В. Цимбалистов, М.А. Дубова. Развитие гастродуоденальной патологии у больных, инфицированных Helicobacter pylori, в стоматологическом аспекте // Вестн. С.-Петерб. ун-та. - Сер. 11. - 2006. - Вып. 1. - С. 110-116.
8. Николаев А.И.; Сойхер М.Г. Особенности течения воспалительных заболеваний пародонта на фоне язвенной болезни с наличием дуодено-гастрального рефлюкса // Сборник трудов VI Межрегиональной научно-практической конференции врачей Приволжско-Уральского округа «Актуальные вопросы военной и практической медицины». – Оренбург, 2005. – том II. – С. 347-349. 
9. Young K. A., Allaker R. P., Hardie J. M. Morphological analysis of Helicobacter pylori from gastric biopsies anddental plaque by scanning electron microscopy // Oral Microbiol. Immunol.— 2001.— № 3.— P. 178–181.
10. Bauermeister C.-D. Микробиологическая диагностика заболеваний тканей пародонта //Новое в стоматологии.-2003.-№7.-С.27-30.
11. Starka M. Parodontologia 2000// New York, 2000.-V.1-p.64.
12. В.Н. Царёв,Е.Н.Николаева, Л.А.Плахтий. Перспективы применения молекулярно-генетических методов исследования в диагностике пародонта //Российский стоматологический журнал.-2002.-№5.-С.6-9.

Резюме.Видовий склад анаеробної мікрофлори пародонтальних кишень у хворих на генералізований пародонти на фоні патології органів щлунково-кишкового тракту.І.І. Соколова, Є.М. Рябоконь, В.В. Олейнічук
Проведено порівняльне вивчення видового складу анаеробної мікрофлори пародонтальних кишень у хворихна генералізовані форми пародонтиту поєднані з H. pylori -ассоційованою патологією органів шлунково-кишкового тракту методом мультипраймерної ПЛР. Встановлено, що при контамінації пародонтальних кишень H. pyloriв них збільшується кількість анаеробної мікрофлори. Запропонована схема ПЛР може бути корисна для діагностики та обгрунтування вибору методу антимікробної терапії.Ключові слова: полімеразна ланцюгова реакція, H. рylori, пародонтит.
Резюме.Видовой состав анаэробной микрофлоры пародонтальных карманов у больных генерализованными формами пародонтита на фоне патологии органов желудочно-кишечного тракта.И.И. Соколова, Е.Н. Рябоконь, В.В. Олейничук.
Проведено сравнительное изучение видового состава анаэробной микрофлоры пародонтальных карманов у больных генерализованным пародонтитомпротекающим на фоне H. pylori -ассоциированной патологии органов желудочно-кишечного тракта методом мультипраймерной ПЦР. Установлено, что при контаминации пародонтальных карманов H. pylori увеличивается в них количество анаэробной микрофлоры. Предложенная схема ПЦР может быть полезна для диагностики и обоснования выбора метода антимикробной терапии.Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, H. Pylori, анаэробная микрофлора, пародонтит.

Resume.Specific structure of anaerobic microflora of parodontalny pockets at patients with generalized forms of a periodontal disease against pathology of bodies of the gastrointestinal highway. I.I.Sokolova, E.N.Ryabokon, V. V. Oleynichuk
The comparative study of specific composition of anaerobic microflora of periodontal pockets is conducted for patients by the generalised forms of periodontitis combinedwith H. by pylori -combined with pathology of organs of gastrointestinal tract by the method of polymerase chain reaction PCR. It is set that at contamination in parodontal pocket; of H. pylori increases in them amount of anaerobic microflora. An offer chart of PCR can be useful to diagnostics and ground of choice of method of antimicrobial therapy.Keywords: polymerase chain reaction, H. Pylori, periodontitis.